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Developmental Biology

El Canal de Excretory C. elegans como modelo de morfogénesis Lumen intracelular y En Vivo biogénesis de la membrana polarizada en una sola celda: etiquetado por fusiones de GFP, ARNi interacción pantalla e imagen

Published: October 3, 2017 doi: 10.3791/56101
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 1
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, 2College of Life Sciences, Jilin University, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau

Summary

El canal excretor de C. elegans es un modelo único de celular solo para el análisis visual en vivo de la biogénesis de la membrana de nuevo polarizado. Este protocolo describe una combinación de genético estándar/ARNi y enfoques, adaptables para la identificación y caracterización de moléculas dirección tubulogenesis unicelulares y biogénesis de la membrana y lumen apical la proyección de imagen.

Abstract

Los cuatro canales excretores de C. elegans son tubos estrechos que se extendió por la longitud del animal de una sola célula, con casi igual ahora extendido endotubes intracelular que construir y estabilizar la luz con una membrana y submembraneous citoesqueleto de carácter apical. La célula excretora amplía su longitud aproximadamente 2.000 veces para generar estos canales, haciendo este modelo único para la evaluación en vivo de de novo polarizado biogénesis de la membrana, morfogénesis lumen intracelular y unicelulares tubulogenesis. El protocolo que presentamos muestra cómo combinar la norma de etiquetado, ganancia y pérdida-de-función genética o ARN de interferencia (ARNi)-y métodos microscópicos para utilizar este modelo para diseccionar visualmente y funcionalmente analizar estos procesos a nivel molecular. Como un ejemplo de un enfoque de etiquetado, el protocolo describe la generación de animales transgénicos con proteínas fluorescentes de fusión para el análisis directo de tubulogenesis. Como un ejemplo de un enfoque genético, destaca puntos clave de una visual basada en RNAi interacción pantalla diseñada para modificar un fenotipo canal enquistada de ganancia de función. Los métodos específicos descritos son cómo: etiquetar y visualizar los canales de expresión de proteínas fluorescentes; construcción de una biblioteca específica de RNAi y estrategias ARNi de detección para el análisis molecular de la morfogénesis del canal; evaluar visualmente modificaciones de fenotipos de canal; puntuación por disección microscopía de fluorescencia; componentes subcelulares canal a resolución mayor se caracterizan por microscopía confocal; y cuantificar parámetros visuales. El enfoque es útil para el investigador que está interesado en aprovechar el canal excretor de C. elegans para la identificación y caracterización de genes implicados en los procesos filogenéticamente conservados del lumen intracelular y unicelulares morfogénesis del tubo.

Introduction

Todos los órganos internos están compuestos por tubos, cruciales para sus muchas funciones diferentes, tales como el transporte y el intercambio de gases, líquidos y nutrientes y la excreción de desechos metabólicos. Su carácter polarizado, con distintas membranas apicales lumenal, está adaptada a estas funciones específicas, y los defectos en la biogénesis de sus sistemas de endo - y de la membrana plasmática son una causa frecuente de enfermedad humana1,2. La mayoría de los tubos de la vasculatura y de órganos internos es multicelular y forma un lumen intracelular; sin embargo, tubos unicelulares, que forman el lumen intracelular, por ejemplo, pueden representar tanto como 30-50% de camas de tubo capilar humana2. Las membranas polarizadas de multi - y tubos unicelulares son similares en composición, aunque su microdominios pueden variar en base a la función específica del tubo (por ejemplo, canalículos excretores canal versus las microvellosidades intestinales en Caenorhabditis elegans de; Ver acompañando a papel en tubulogenesis intestinal C. elegans )3. Los principios de la biogénesis de la membrana polarizada y tubulogenesis se conservan entre los metazoos, y una maquinaria molecular similar dirige1,2,4.

El sistema excretor de C. elegans consiste en cinco células: la célula excretora (EC), célula del conducto (DC), poro (PC) de la célula y dos células de la glándula. Ablación de la CE, la DC o la PC causa acumulación de líquido en la cavidad del cuerpo y lo animales mueren a una temprana etapa larvaria5. Curiosamente, estos tres tubos unicelulares crean sus lúmenes de tres maneras diferentes: por célula de vaciamiento (CE); envoltura celular junto con la formación de la ensambladura de autocellular (PC); y por la envoltura de la célula junto con autofusion (DC); diferentes mecanismos de la morfogénesis de la luz que los filogenéticamente conservados6,7. La CE, situada en el lado lateral izquierdo del bulbo faríngeo posterior, envía dos extensiones laterales de que los cuatro canales se ramifican para ampliar anterior y posteriormente (en el lado derecho e izquierdo) a la punta de la nariz del gusano y cola , respectivamente (figura 1)5,6,8. La CE se extiende de aproximadamente 1 μm a 2 x 1.000 μm, lo que es la célula más grande en el animal. A nivel subcelular, el conducto excretor es un tubo simple, generado a partir de una membrana basal hacia el pseudocoelom y canalizado por una membrana lumenal (endotube). La membrana lumenal de canal se conecta a la membrana lumenal de conductos en su unión sólo intercelular; los canales son de otra manera junctionless a lo largo de su longitud (figura 1). La membrana lumenal de conducto excretor y su citoesqueleto de submembraneous son apicales, definidos por su composición molecular que se asemeja a la composición de la membrana apical y citoesqueleto de submembraneous de tubos pluricelulares, como el intestino, y de otros epitelios (por ejemplo, planos). Orgánulos citoplásmicos, incluyendo endosomal vesicular y otros (p. ej., Golgi) endomembranas se distribuyen a lo largo de la longitud del canal. Además, múltiples vesículas con canalículos - conectado a la membrana del lumenal, o interconectados o aislados - se roscan a través del canal citoplasma7,8,9,10 . Esta conexión con plasma-membrana/canalículos dinámica más amplía sistema de membrana del canal y contribuye a ambos lumen morfogénesis y osmoregulación10. El canal excretor así consiste casi enteramente de endo - y las membranas de plasma, proporcionando un excelente modelo para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada y la regulación de la endo-interfaz de la membrana plasmática. La dramática expansión de la membrana apical durante la morfogénesis de la canal - en este sistema unicelular coincidente con la extensión de la luz – también permite para analizar los problemas arquitectónicos que se presenta por la necesidad de estabilizar y una membrana intracelular del lumenal del centro . Este protocolo se centra en el análisis de la morfogénesis estructural canal tubo y del lumen y la dinámica de la membrana intracelular necesaria para este proceso en lugar de las señales que dirigen los movimientos celulares que generan posición de la CE en el sistema excretor y sus intrincadas conexiones con otros elementos celulares (revisados en6).

Otra ventaja del sistema de canal sola célula C. elegans para el análisis de membrana polarizada y biogénesis de lumen intracelular es su capacidad para separar, a través del tiempo del desarrollo, la generación de los diferentes componentes de sus membranas y uniones. La CE nace en el momento de cierre ventral y se instala ventro-lateral de la faringe durante mediados embriogénesis5,6,8, durante el cual tiempo canal lateral extensión y ramificación se producen. Esto es seguido por la extensión del canal antero-posterior durante la embriogénesis tardía, un proceso que continúa en la etapa larval L1 (figura 1). En una larva recién eclosionada, la punta posterior alcanza aproximadamente la mitad de la lombriz, completamente que se extiende hasta la cola al final de la fase L1, después el canal se alarga junto con el gusano8. Crecimiento activo de la canal a una velocidad superior a la del crecimiento del animal así termina en la primera etapa larval, sin embargo, más crecimiento se produce en paralelo con el crecimiento del animal entero durante las etapas larvales adicionales (L2-4). Esta configuración proporciona la oportunidad de analizar los diferentes pasos de biogénesis de membrana de novo polarizados independientes de la división de célula polarizada o migración. Además, permite la separación de este proceso desde el montaje de uniones (que ocurren en el embrión antes de la iniciación de lumen); su requisito exacto en la polarización de la membrana es todavía una cuestión abierta en el campo de la polaridad. Por último, únicamente separa apical de expansión de la membrana basal, este último proceso anterior a la anterior en los canales excretores10. El modelo del canal excretor de C. elegans , resulta un complemento especialmente informativo para el modelo intestinal que comparte un número de estas ventajas para el análisis de la biogénesis de la membrana polarizada pero se ejecuta en un entorno multicelular (véase el documento acompañante sobre intestinal tubulogenesis3).

Aunque canales de tipo salvaje son túbulos ultrafinos en este pequeño gusano, sus lúmenes pueden ser visualized directamente por la óptica Nomarski en este animal transparente. De hecho, morfologías del conducto enquistado mutante pueden ser caracterizados en animales sin etiqueta con ampliación baja disección microscopía, que se ha utilizado con gran efecto en adelantados pantallas genéticas para identificar genes implicados en la tubulogenesis11. Mejor visualización de la morfología de canales y distinción de sus membranas polarizados, componentes del citoesqueleto, organelos intracelulares diferentes y otras estructuras subcelulares, sin embargo, requiere de etiquetado y más alto de energía fluorescente microscopía confocal y disección. Aunque estructura fina de los canales plantea una serie de dificultades para el etiquetado y microscopía, membranas y componentes subcelulares pueden distinguirse a través de las moléculas específicas únicas para cada compartimiento, y animales se pueden montar con seguridad para microscopía si ciertas precauciones se toman para evitar la introducción de artefactos (ver Protocolo y discusión). Etiquetado puede hacerse mediante inmunohistoquímica en muestras fijas, o mediante la generación de gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescentes de fusión bajo el control de su propia o excretores promotores de canal específicos para proyección de imagen en vivo . Este protocolo describe el etiquetado última técnica (consulte el documento adjunto en tubulogenesis intestinal para el anticuerpo de tinción3).

La capacidad de combinar estudios de pérdida o ganancia de función en vivo en vivo imágenes de análisis en la célula de nivel a lo largo del desarrollo hace el canal excretor de C. elegans un modelo particularmente fuerte para el molecular y Análisis celular de tubulogenesis unicelulares. Avanzar o retroceder pantallas genéticas pueden realizarse a partir de un animal transgénico tipo salvaje o con etiquetado para identificar fenotipos de morfogénesis de canal (por ejemplo, quistes) y sus defectos genéticos subyacentes. Alternativamente, estas pantallas pueden iniciar con un fenotipo mutante (por ejemplo, un conducto enquistado) e identificar supresores o potenciadores de este fenotipo para identificar genes que interactúan funcionalmente con el gene que causa el fenotipo mutante. El defecto genético que causa el fenotipo mutante puede inducir una pérdida (por ejemplo, a través de canceladura del gene) o un aumento (por ejemplo, a través de una mutación activante o a través de la introducción de copias del gen exceso) de la función investigada. Adelante mutagénesis o ARNi sistemática pantallas sin ideas preconcebidas sobre la función del gen y permitan la identificación objetiva de los genes implicados en la función de interés. Teniendo en cuenta la disponibilidad de genoma-ancha de RNAi alimentación bibliotecas, casi cada gen puede ser fácilmente derribado por RNAi en la C. elegans, tal que cualquier solo gen de interés o de cualquier grupo de genes (por ejemplo, en pantallas específicas) puede también ser rápidamente sondeado por su efecto en un enfoque de genética reversa. Para demostrar una posible combinación de enfoques, aquí describimos una pantalla específica de interacción ARNi, a partir de un mutante del canal excretor enquistada de ganancia de función, con proteína fluorescente citoplásmico canal verde (GFP). El fenotipo mutante se generó por la sobreexpresión de erm-1, un altamente conservados C. elegans ortholog de la familia de vinculador de membrana-actina Ezrin-Radixin-moesina (ERM), que ha sido implicada en la morfogénesis de la luz y la membrana organización en muchas especies12. C. elegans ERM-1 se localiza en membranas lumenal de órganos internos, como el canal excretor y el intestino y es necesario para la formación del lumen en ambos13. Sobreexpresión de ERM-1 recluta a actina exceso y vesículas a la membrana lumenal de canal, aumentar el flujo en el lumen y la generación de un corto canal enquistado y una membrana lumenal prensada con actina engrosada capa9. El protocolo describe cómo generar cepas transgénicas con expresa de canal excretor etiquetado como proteínas de fusión (u otras proteínas); Cómo hacer pantallas de ARNi dirigidas a partir de dichas cepas, para identificar los modificadores del fenotipo de un canal; y cómo analizar visualmente los resultados de tales pantallas por microscopía confocal y disección de fluorescencia, incluyendo formas sencillas de cuantificar los fenotipos tubulogenesis informativo. Alternativa etiquetado técnicas y los detalles de RNAi, ajustado a los genes tubulogenesis a menudo letal, puede encontrarse en el documento de acompañamiento en la tubulogenesis intestinal3. Todos los métodos se pueden utilizar en varias combinaciones para la investigación de otras preguntas en el canal tubulogenesis.

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Protocol

1. etiquetado del C. elegans Excretory Canal por proteínas fluorescentes de fusión 14

Nota: Consulte el documento adjunto en tubulogenesis intestinal 3 para el etiquetado en situ anticuerpo procedimientos de tinción adaptable al canal excretor. Ver cuadro 1 para ejemplos de moléculas demostrado ser útiles para la visualización de C. elegans canal excretor endo - y las membranas de plasma, tabla 2 para ejemplos de expresión de la conducción del canal excretor, promotores y Tabla 3 recursos para colecciones de marcadores y promotores más completa, incluyendo referencias sobre la selección de fluoróforos diferentes.

  1. Construcción de plásmidos de marcador fluorescente específico de tejido por enzima de la restricción en clonación 15
    Nota: ver la discusión de técnicas alternativas de construcción de proteínas fluorescentes de fusión.
    1. Identificar la secuencia del promotor (para fusiones transcripcionales) o del gene entero de interés con su promotor (para fusiones traslacionales) en WormBase 44.
      Nota: para los promotores, alrededor de 1 – 3 kilobases (kb) son suficiente para la mayoría de los genes C. elegans. Proteínas de fusión traduccional pueden también construirse colocando un gen de interés bajo un promotor específico del canal excretor (ver tabla 2).
    2. Diseño de cartillas de avance y retroceso para la amplificación de la promotora (para fusiones transcripcionales) o un gen completo con promotor (para fusiones traslacionales). Añadir enlazadores de enzima de la restricción en el 5 ’ y 3 ’ extremos de las cartillas de.
      Nota: Elija las enzimas de restricción que están presentes en el vector plásmido (e.g., pPD95.79) 16. Para fusiones de traslacionales, los 3 ’ vinculador debe diseñarse para que después de la digestión de la enzima de la restricción y la ligadura con el vector, el marco de codón de insertar será continuo con los codones del fluoróforo, por ejemplo, GFP. Uno puede necesitar añadir 1 o 2 bases más a la enzima de restricción típica enlazadores 14; Tenga cuidado de no para crear un codón de parada.
    3. Polimerasa realice la reacción en cadena (PCR) para amplificar el promotor o el gen integral utilizando gusanos vivos o tipo de ADN genómico o cDNA como plantilla 15.
      Nota: Al usar gusanos como plantilla, primero lyse gusanos de lysis buffer (tampón PCR más proteinasa K) 17. Gusanos de fase mixta se pueden utilizar como plantilla. Gusanos hambrientos pueden utilizarse para evitar la contaminación con ADN bacteriana.
      4. Electroforesis de productos PCR para identificar el tamaño correcto del producto amplificado del gel
    4. realizar agarosa (1%).
      Nota: Si el tamaño de banda es correcta, continúe con el paso siguiente. Si se generan múltiples bandas, mejorar las condiciones de amplificación para producir una banda. Si esto no funciona, cortan la correcta banda de gel y purificar DNA por métodos estándar 15 y luego proceda con el siguiente paso.
    5. Recopilación de restricción de realizar sobre el producto PCR y el plásmido vector que contiene el fluoróforo (e.g., pPD95.79) en tubos separados por métodos estándar 15.
    6. Separar el ADN digerido por electroforesis en gel y eluir el producto PCR y vector bandas de DNA en tubos separados.
    7. Purificar las DNAs de rodajas de gel mediante métodos estándar 15. Medir la concentración de DNA por espectrofotómetro.
    8. Ligar el producto PCR y vector de ADN por métodos estándar y transformar el ADN recombinante en células competentes por métodos estándar 15.
    9. Extensión 10 μL, 50 μL y 100 μL de las células transformadas en tres platos individuales de caldo Luria (LB) suplementados con ampicilina 50 de μg/mL.
      Nota: Difundir diferentes cantidades de células en placas diferentes para un espectro de eficiencia de transformación. Por ejemplo, demasiado densamente la galjanoplastia no podrá permitir el aislamiento de colonias si la transformación es eficiente.
    10. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche. A la mañana siguiente, saque las placas de la incubadora.
      Nota: Si las colonias son muy pequeñas, incubar durante varias horas más.
    11. Preparación de plásmido DNAs de colonias solo por métodos estándar 15. Mezcla de DNA de la plantilla y las cartillas y enviar para la secuencia (generalmente realizada en un centro de servicio de base).
    12. Leer las secuencias y verificar la integridad de la fusión construcción.
      Nota: crítica: confirmar el marco codón correcto entre gene insertado y gene marcador fluorescente para fusiones de traducción. Idealmente, la secuencia del gene entero para confirmar que ninguna mutación fue introducida durante los procedimientos PCR y la ligadura.
    13. Generar más DNA plasmídico (usando paso 1.1.11) para la inyección de paso 1.2.
  2. Generación de animales transgénicos por microinyección de ADN para la transformación del germline 18
    Nota: ver la discusión de técnicas alternativas para la introducción de los transgenes. Los procedimientos de contorno pueden utilizarse para generar animales transgénicos que llevan una proteína de fusión de fluorescencia o cualquier otra proteína de interés. Por ejemplo, una proteína exógena puede ser recién introducido (por ejemplo, un ortholog heteróloga) o una proteína endógena puede ser reintroducida (p. ej., en su correspondiente mutante del germline para rescate) o overexpressed para generar un fenotipo (por ejemplo, inyección de de erm-1 se utilizó para generar el fenotipo de conducto enquistado de la sobreexpresión que sirve como blanco para la modificación de la pantalla de interacción de ARNi que se describe a continuación).
    1. Mezcla de construcción de ADN (1 – 50 ng/μL) con el plásmido marcador ADN (típicamente 100 ng/μL), por ejemplo el marcador dominante rol-6 (su1006) (véase 1.2.3 para opciones de marcador).
      Nota: crítica: concentración de ADN inyectado debe determinarse empíricamente para evitar introducción de fenotipos artefactuales (quistes, extensión defectos, mortalidad) cuando expresan los genes en los canales excretores que son particularmente sensible a la expresión de los transgenes. Uno puede, por ejemplo, hacer varias mezclas de plásmidos en concentraciones de 1 ng/μL, 10 ng/μL, 50 ng/μL y 100 ng/μL con 100 ng/μL rol-6(su1006) para probar una gama de concentraciones para la generación de una cepa viable con la expresión deseada o fenotipo (concentraciones altas es probables que no específicamente tóxicos para la morfogénesis del conducto y puede ser mortales).
    2. Filtrar la mezcla de ADN a través de un filtro 0,22 μm (micrómetro) poro tamaño spin x centrífuga tubo.
      Nota: No deje la tapa del tubo abierto para evitar el polvo que puede bloquear las agujas microinyección.
    3. Microinject plásmidos recombinantes en la gónada de gusanos tipo salvaje o mutantes por métodos estándar de transformación de la línea germinal (ver referencia 18 para detalles).
      Nota: Los plásmidos marcador estándar son, por ejemplo: rol-6(su1006), dpy-20, unc-119, pha-1. Los transgenes dominantes como rol-6(su1006) se introducen en gusanos del tipo salvaje, que rescate los transgenes se introducen en sus respectivos mutantes. Los plásmidos de marcador son co-inyección para un fácil mantenimiento de las líneas transgénicas ya que los transgenes extracromosómicos se pierden al azar durante la división celular (ver 1.2.8). Cuando la inyección de genes que codifican para el fluoróforo fusiones, se puede también utilizar el fluoróforo, GFP, sí mismo como marcador. rol-6 induce gusanos a rodar alrededor de sí mismos que a menudo es ventajoso para la evaluación de fenotipos morfogénesis.
    4. Transferencia inyectado gusanos en Escherichia coli sembradas las placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) (p. ej., placa de gusanos 5) (ver referencia 19 para estándar C. elegans procedimientos de cultivo y mantenimiento y Tabla de materiales).
    5. Incubar las placas y dejar progenie desarrollar a 20 ° C para aproximadamente 3 d.
    6. Examinar la progenie F1 con el microscopio de disección para gusanos (balanceo) de Rol (o cualquier otra inyección específico marcador, por ejemplo, GFP) y selección de rodillos tplacas individuales o.
    7. Seleccionar las placas con el balanceo los animales F2 y confirmar la presencia de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia disección (todos los animales de rodillo son generalmente GFP positiva).
      Nota: F2 rodillos indican la generación exitosa de una línea transgénica. Líneas individuales pueden ser diferentes, por ejemplo, con respecto a la tasa de transmisión del transgen. Por lo tanto es útil mantener y almacenar varias líneas de.
    8. Mantener las líneas transgénicas enriqueciendo nuevas placas para marcador positivo animales.
      Nota: El ADN inyectado se incorpora en la línea germinal como una matriz Extracromosómica. Las tasas de transmisión para las matrices extracromosómicas son variables pero generalmente alrededor de ~ 50%. Para no perder la cepa, por lo tanto, es fundamental para enriquecer manualmente líneas con marcadores dominantes (p. ej., líneas no aseguradas por selección negativa).
    9. Congelación de líneas transgénicas por técnicas de congelación estándar para el almacenamiento a largo plazo a-80 ° C 19.
      Nota: Transgenes en arreglos de discos extracromosómicas puede también integrarse en la línea germinal por la irradiación UV en un paso adicional para producir líneas homogéneas 18. Por ejemplo, erm-1 fue integrado en la línea germinal por la irradiación de UV para obtener la cepa de MTC-1 [++] fgIs2[erm-1p::erm-1;rol-6p::rol-6(su1006)] donde cada animal lleva el transgen, un requisito para su uso en RNAi pantalla de interacción se describe a continuación. Esta cepa fue etiquetada además por canal excretor citoplásmico GFP via cruce en una cepa que contiene un vha - 1P:: GFP transgen (generada por los mismos procedimientos señalados anteriormente; ver referencia 20 básica genética procedimientos tales como cruces) y se conoce como ERM-1 [++]; VHA - 1P:: cepa GFP abajo.

2. Construcción de una biblioteca de ARNi objetivo y diseño de una pantalla de interacción de RNAi para modificar un fenotipo de Canal

Nota: una pantalla específica interacción genética basada en RNAi se describe que utiliza un fenotipo de conducto enquistado de sobreexpresión a búsqueda de genes de morfogénesis de interacción canal excretor. La cepa de MTC-1 [++] (vea el paso 1.2.9) sirve como ejemplo 9. Este enfoque presenta sólo uno de muchos posibles enfoques para el análisis genético de la morfogénesis de lumen del canal excretor (véase la Introducción y la discusión para otros enfoques genéticos). Consulte el documento adjunto en tubulogenesis intestinal 3 y referencias 17 , 21 , 22 de fondo en ARNi, detalles de RNAi procedimientos, modulación de fuerza de RNAi (ajustado a los genes tubulogenesis a menudo letal) y la discusión de problemas técnicos conexión a ARNi. Ver referencia 19 de gusano estándar cultura y mantenimiento y tabla de materiales.

  1. Moléculas interactuantes buscar ERM-1 (u otro gen de interés) en las bases de datos y artículos publicados.
    Nota: Interactianos de ERM-1 potencial incluiría todas las moléculas que experimentalmente se demostraron que genéticamente, físicamente o funcionalmente interactuar con las proteínas ERM en cualquier especie o fueron predichas por cualquier de silico, alto rendimiento o enfoque de Biología de sistemas (ver tabla 3 para ver ejemplos de bases de datos y recursos).
  2. Generar una lista de todos los genes y encontrar homólogos de C. elegans cuando sea necesario.
    Nota: Considerar ampliar la lista de genes identificados para las clases de gene, que toma en cuenta la función del gen de interés y amplía la red para la identificación de interactianos (p. ej., el vinculador de membrana-actina ERM-1, seleccione todas las actinias y moléculas de actina).
  3. Identificar el ARNi correspondiente alimentación de clones disponibles comercialmente genoma bacteriano RNAi las bibliotecas para todos los genes bacteriano (p. ej., Ahringer genómica C. elegans ARNi alimentación biblioteca 21; Tabla de materiales)
  4. Generar una hoja de cálculo para todos los genes y su correspondiente placa de RNAi y número bien.
  5. Selección y raya ~ 50 clones de ARNi en placas de LB/ampicilina/tetraciclina (elección del antibiótico se determina por la construcción de la biblioteca) por día y continuar hasta dirigido ARNi biblioteca genera.
    Nota: Dependiendo del tamaño de la biblioteca y flujo de trabajo previsto, omitir la generación de una biblioteca y continuar directamente con el análisis de lote. Las placas pueden almacenarse a 4 ° C, durante no más de aproximadamente 2 semanas (si es necesario, volver a raya en placas nuevas después de eso). Por el contrario, uno puede generar grandes bibliotecas congeladas en replicados formatos bien 96 o 384 pocillos para almacenamiento a largo plazo a -80 ° C.
  6. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche. A la mañana siguiente, quitar placas de incubadora y almacén a 4 ° C.
  7. ARNi recoger las bacterias de una placa por un palillo de dientes estéril, mezclar bacterias con 600 μL de caldo LB/ampicilina (50 ng/μL) microtubos de 1.5 mL, incubar los tubos a 37 ° C, agitar durante 6 h.
    Nota: Inocular bacterias de RNAi en el caldo frotando el pico (punta de un palillo o una micropipeta) a lo largo del lado del microtubo.
  8. Semilla de 70 μL cultiva bacterias en cada pozo de 6 bien placas de ARNi en sets duplicados o triplicados. Incubar las placas de ARNi a 22 ° C durante la noche.
    Nota: Placas de RNAi son generadas por procedimientos estándar (Tabla de materiales y referencias 3 , 17 , 21) y utilizadas aquí en un tejido bien 6 formato de placa de cultura para un mayor enfoque de rendimiento que aún permite la evaluación microscópica de la morfogénesis de la canal en animales vivos en las placas de.
  9. Siguiente mañana, etapa de L4 pick 3 ERM-1 [++]; VHA - 1P:: GFP gusanos en cada pocillo de las placas de RNAi.
    1. Para evitar la contaminación con bacterias OP50 (ver referencia 19) que interfieren con ARNi primero sembrar las lombrices en un plato NGM sin bacterias y dejar que los animales arrastrarse durante unos 10 minutos. Utilizar únicamente animales sanos no de hambre.
  10. Incubar las placas a 22 ° C para 3 d permitir que los animales producir progenie.
  11. Examinar fenotipos de canal en la progenie F1 con el microscopio de fluorescencia disección.

3. En Vivo Proyección de imagen del Canal Excretory C. elegans por microscopía de fluorescencia de disección y puntuación de los fenotipos Tubulogenesis

  1. preparar una hoja de puntuación de fenotipo (ejemplo que se muestra en la tabla 4 y figura 5 ).
  2. Coloque la placa de agar con gusanos directamente debajo de la dissectin de fluorescenciag microscopio, abra la tapa de la placa para la evaluación, utiliza menor aumento a foco.
    Nota: Este protocolo describe el uso de un endoscopio con 1, 5 X y 10 X objetivos y un rango de zoom de 3,5 a 45 (Tabla de materiales).
  3. Evaluar animales por centrándose en cada bien por separado, a partir de 1 pozo y abajo la placa de.
    Nota: Siempre comience con la evaluación de los controles. Por ejemplo, un mock (vector vacío) control (ARNi HT115 bacterias (ver referencia 17 , 21) sin o con una inserción de genes sin relación) negativo y caso positivo controla, por ejemplo, en Esta pantalla de interacción, erm-1 RNAi (suprime el fenotipo de ERM-1 [++]) y sma-1 / spectrin RNAi (mejora el fenotipo de canal de ERM-1 [++]).
  4. Primer lugar, examinar general fenotipos visibles bajo luz brillante (por ejemplo: dejar/letal, Clr/claro, Emb, embrionario letal, Ste estéril, Unc/coordinación, Dpy/rechoncho, etc.), cuantificar el fenotipo contando el número total de animales y de animales con el fenotipo, grabar los números (ver tabla 4).
    Nota: Para caídas de genes que causan los defectos que puedan afectar la evaluación de fenotipos de canal (p. ej., OE, Ste), consideran repetir el experimento con condicional, post embrionario RNAi (ver acompañando a papel de procedimientos 3 ).
  5. En segundo lugar, examinar fenotipos canal excretor bajo luz fluorescente, marcar fenotipos cuantificables (por ejemplo, longitud de canal, ancho de lumen, quistes), grabar los números y describir fenotipos en una hoja de puntuación (ver tabla 4, < fuerte clase = "xfig" > Figura 5).
    Nota: Aumento mayor con un rango de zoom es necesaria para evaluar fenotipos canal sutil más. Moverse hacia adelante y hacia atrás entre alta y baja magnificación para evaluar cuidadosamente el canal ’ s longitud y anchura y otro fenotipo de morfogénesis de canal. Para la cuantificación o semi-cuantificación de fenotipos simple, contar 100 animales (e.g., L4s en esta pantalla específica de RNAi; fenotipos: canal longitud de 1/4, 1/2, 3/4 y la completa extensión de los canales posteriores y diámetro de lumen de los canales posteriores, pequeño quistes (< 1/3 del ancho del animal), los quistes grandes (> 1/3 del ancho del animal); Ver tabla 4).
  6. Adquisición de imágenes de los fenotipos predominantes de por lo menos 3 diferentes animales por un microscopio montado cámara digital dispositivo de carga acoplada (CCD) y el correspondiente software de proyección de imagen (véase Tabla de materiales)
    1. para la adquisición de imágenes, primero encender la cámara, encender ordenador acoplado, haga doble clic en el icono del software de captura de imagen, un área de la placa de gusano manualmente bajo ampliación baja de enfoque y abrir el obturador de la cámara.
    2. Haga clic en el “ vista previa en vivo ” icono del software de captura de imagen en la pantalla del ordenador para visualizar los gusanos en la pantalla del ordenador, ajuste el enfoque manualmente a claramente visualizar los gusanos en la pantalla, a continuación, haga clic en el “ rápido ” icono, luego Haga clic en el “ guardar ” icono.
      Nota: Los animales se mueven más rápido bajo luz fluorescente, por lo tanto, mantenga una mano en ratón de la computadora listo mientras se mueve la placa en el área de interés con la otra mano. Haga clic inmediatamente en el “ rápido ” icono para adquirir la imagen. Normalmente es posible adquirir una buena imagen con varios intentos.
    3. Guardar las imágenes adquiridas con un nombre de archivo apropiado (incluir nombre de la cepa, ARNi clon y fecha).
      Nota: Más rápido movimiento gusanos de tipo salvaje con canales delgados y largos son más difíciles a la imagen de mutantes. Mutantes con canales enquistadas u otros fenotipos son propensos a moverse lentamente, facilitando la proyección de imagen. Plásmidos de marcador como Rol pueden ser útiles para la proyección de imagen por animales “ in situ ” en lugar de moverse hacia adelante y también puede proporcionar una mejor visión en el fenotipo con el animal en sí mismo.

4. Proyección de imagen del Canal Excretory C. elegans en alta resolución por microscopia Confocal de exploración láser

  1. montaje animales vivos
    1. Coloque una pequeña cantidad de grasa o vaselina en la punta de un hisopo de algodón o en la punta de la Índice dedo y se extendió la grasa para generar un círculo ultrafino con un diámetro de ~ 6 – 8 mm en el centro de un portaobjetos de vidrio limpio.
    2. 6 lugar μL 5% solución de lidocaína (anestésico) en el círculo de una micropipeta.
      Nota: Es posible una solución lidocaína disolviendo polvo de lidocaína en el agua. Diluir al 5% con M9 buffer 19 (Tabla de materiales). Es fundamental para el análisis del canal excretor para evitar las soluciones inmovilización comunes (tales como la azida de sodio) que causan los quistes a la ruptura y que inducir fenotipos canal.
    3. Escoger varios animales de una placa de ARNi y colocarlos en la solución de lidocaína por immerging gusano pick 19 en la solución de.
      Nota: Preferiblemente escoge animales de escenario específico que facilitarán el montaje incluso por espesor uniforme. Animales pueden preseleccionarse en el microscopio de fluorescencia disección.
    4. Colocar un cubreobjetos de 22 x 22 mm, sobre el portaobjetos de cristal, dejarla asentarse suavemente en el círculo de grasa.
      Nota: No aplique ninguna presión física sobre el cubreobjetos que pueden dañar la morfología de la canal, especialmente en mutantes o gusanos de ARNi tratado con canal y posiblemente otros fenotipos. Por lo tanto es importante evitar un círculo grueso de grasa; Idealmente los animales suavemente se intercalan entre vidrio portaobjetos y cubreobjetos.
    5. Escribe el nombre de la muestra en el lado esmerilado de lo portaobjetos de vidrio. Tomar inmediatamente el portaobjetos al microscopio confocal para el análisis del fenotipo de canal y adquirir imágenes.
      Nota: Retrasos pueden resultar en daños de los quistes del canal o cambiar de morfología de canal luz.
  2. Adquirir imágenes confocales
    1. colocar el portaobjetos en la etapa de muestra del microscopio confocal, centran los gusanos a bajo aumento (10 X).
    2. Vista y seleccione los animales bajo 60 X y objetivos de 100 X, examinar el canal excretor ’ celular s y subcelulares fenotipos, por ejemplo, lumen forma y diámetro, tamaño y forma de quistes; o de los componentes subcelulares etiquetados para su análisis, por ejemplo,, membrana apical/lumenal, membrana basal, citoplasma, endosomal versus vesículas con canalículos, otros organelos (véase discusión, figura 2 y figura 4).
    3. Imágenes de la adquisición del fenotipo específico de interés.
      Nota: Este protocolo describe el uso de un láser de barrido confocal microscopio (Tabla de materiales). Para resolver los componentes subcelulares en el delgado C. elegans tienen canales excretores, objetivos de ampliación superiores (60 X a 100 X). Un microscopio confocal de disco giratorio se puede utilizar para adquirir imágenes de lapso de tiempo pero ofrece menos confocality (ver discusión).
      1. Para adquirir imágenes confocales, encender el ordenador, haga doble clic en el software del microscopio confocal y seleccione el laser haciendo clic en el icono de un láser específico.
      2. Haga clic en el “ análisis ” icono para visualizar el gusano centrado en la pantalla del ordenador, ajustar la intensidad del láser a través de la software y haga clic otra vez en “ análisis ” icono para detener la exploración, haga clic en “ capturar ” icono para capturar una imagen, haga clic en “ guardar ” icono.
      3. Guardar imágenes con nombre de archivo apropiado e incluyen nombre de clon de ARNi, cepa y fecha.
        Nota: Imágenes pueden ser adquiridas como solo y varias secciones (por ejemplo, 10 – 15 secciones a lo largo del eje z). Seccionamiento permite la visualización 3D. Adquisición de proyección de imágenes y guardar por separado si es necesario (dependiendo del microscopio). Para una resolución óptima, utilice configuración de láser con baja ganancia, no abrir el agujero de alfiler demasiado y agregar varios promedio por imagen (ver referencias 23 , 24 para la discusión general de proyección de imagen confocal). Tenga cuidado al adquirir imágenes con un brillo por debajo del nivel de saturación para permitir la modificación por software de imágenes si es necesario (preferiblemente imágenes de uso sin modificar).
      4. Adquisición de imágenes de doble o multiplicar canales etiquetados (por ejemplo, verde, rojo y azul) de la misma manera, haciendo clic en varios iconos de láser, pero utilizar exploración secuencial para evitar el repintado entre canales (fundamentales para estudios de colocalización).
        Nota: Uno puede necesitar tener en cuenta el tiempo requerido para el escaneo secuencial (que también resulta en un correspondiente aumento en foto blanqueo) y modificar la configuración de escáner. No analizar los animales de una diapositiva durante más de 30 minutos máximo para evitar efectos no específicos en la morfología del canal. Montaje nueva diapositiva si se requiere el análisis más.
      5. Adquirir correspondiente óptica de interferencia diferencial (DIC) / imágenes de Nomarski, particularmente si la cuantificación de canal diámetro longitud y luz en relación con el gusano ’ s cuerpo longitud y diámetro. Superposición de fluorescencia y Nomarski imágenes haciendo clic en “ recubrimiento ” icono para demostrar puntos de referencia ( figura 1 y Figura 4A – D).
    4. Para la cuantificación, medir la intensidad de fluorescencia de un marcado componente de interés de ImageJ software 25 ( figura 5).

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Representative Results

Este protocolo describe cómo utilizar los canales excretores de C. elegans molecularmente y visualmente analizar tubulogenesis unicelulares y morfogénesis lumen intracelular en una sola celda. Durante su extensión desde el medio de la embriogénesis hasta la edad adulta, los cuatro canales excretores continúan expandiendo su basolateral y membranas apical/lumenal junto con su sistema de endomembrane con canalículos y endosomal, proporcionando un modelo único para el análisis en vivo de novo polarizado biogénesis de la membrana (figura 1). Componentes subcelulares como las membranas apicales del citoplasma y endosomal versus vesículas con canalículos pueden visualizarse por expresión de proteínas de fusión fluorescente específico (descritas en el artículo 1 del Protocolo), y se pueden diferenciar unos de otros por doble o triple de etiquetado en un solo animal transgénico (figura 2). Un fenotipo único canal excretor (Figura 3A-B) generado por overexpressing una molécula de membrana apical asociada (ERM-1), se utiliza para demostrar cómo hacer una pantalla de ARNi dirigida para identificar los genes funcionan en membrana apical y Biogénesis del lumen; Esto sirve como un ejemplo de un análisis molecular y visual de la biogénesis de la membrana polarizada en este modelo (descrito en el artículo 2 del Protocolo). Este fenotipo de canal de ERM-1 [++] se utiliza para demostrar cómo evaluar visualmente y supresión de la puntuación (figura 3– D) y mejora (figura 3E-F) por disección microscopía de fluorescencia (descrito en el artículo 3 del Protocolo) . Fenotipos de canal inducidos por la modulación de ERM-1 niveles sirven para mostrar cómo resolver defectos en el nivel subcelular por microscopía confocal (figura 4) (descritos en el artículo 4 del Protocolo) y cómo cuantificar fenotipos de canal simple (longitud de canal y quiste tamaño) y defectos de la biogénesis de la membrana apical (figura 5).

Figure 1
Figura 1 : Morfogénesis del C. elegans Excretory Canal y estructuras subcelulares de Canal
(A) representación esquemática de la extensión del canal excretor (líneas azules) durante el desarrollo del embrión y la larva. La célula excretora alcanza su ubicación final en la parte ventro-lateral izquierda del bulbo faríngeo posterior en la etapa de comas del embrión (no mostrado). Como el embrión se alarga, se extiende primero dos brazos lateralmente hacia los lados izquierdo y derecho; entonces cada brazo se bifurca en una rama anterior y posterior. Estas ramas anteriores y posteriores se extienden más en alargamiento del animal durante cuatro estadios larvarios, primero ponerse al día con el crecimiento del animal en la fase L2, luego acompañando su crecimiento, hasta la edad adulta. De novo polarizado membrana biogénesis soporta esta extensión hasta la edad adulta. (B) en el animal adulto, las ramas del canal anterior llegar a la punta de la nariz y las ramas posteriores, la cola (líneas azules). El cuerpo de la célula excretorio se muestra junto a la lámpara faríngea posterior (azul). Dominios de membrana polarizada se mantienen durante la edad adulta. (C) amplía puntos de vista de una sección del brazo del canal. Izquierda: vista 3D de la muestra de canal: membrana basal (negro), citoplasma (azul), membrana lumenal (verde) y la luz (blanco). Derecha: vista interior del canal y sus membranas: membrana basal (negro), citoplasma (azul), endosomas (óvalos amarillos), vesículas con canalículos (esferas blancas, vesículas solo conectadas con cada otro, conectado a la luz o aislado), membrana apical (verde) y la luz (blanco). (D) Confocal/DIC micrografías de recubrimiento de la célula excretora en un embrión y los canales excretores en una larva, por lumenal versus citoplásmico GFP, respectivamente. Imagen izquierda: célula excretora (flecha verde) en un embrión de 1.5-fold, con el lumen del canal visualizado expresando apical ERM-1::GFP bajo el promotor de erm-1 . Imagen derecha: cuatro excretor canal ramas (flecha verde) en larvas L3, visualizadas por citoplásmico vha - 1P:: GFP. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Visualización de componentes subcelulares en los brazos del Canal excretor de tipo salvaje de doble etiquetado con proteínas fluorescentes de fusión
(A) distinguir el citoplasma de la membrana apical. Expresión de GFP bajo el promotor sulp-5 visualiza el citoplasma de la canal (verde, arriba); expresión de ERM-1::mCherry bajo su propio promotor visualiza la membrana apical (rojo, media); fusión de estas imágenes (parte inferior) se distingue entre el citoplasma y la membrana apical que sería indistinguible por etiquetado solo incluso a gran aumento. Barra de escala = 5μm. (B) determinar la relación espacial de vesículas endosomal a la luz. Visualización del lumen por un apical asociada a membrana GFP proteína de fusión (pseudo coloreada rojo, superior); visualización de las vesículas endosomal expresando mCherry::RAB-7 (pseudo coloreada azul, media); fusión de las imágenes (abajo) muestra las posiciones relativas espaciales de vesículas endosomal a la luz. Barra de escala = 5μm. (C y D) Resolución de formas de tubo del canal versus componentes subcelulares canal en diferentes aumentos. El citoplasma de las larvas L1 se etiqueta expresando GFP bajo el promotor sulp-5 y vesículas citoplasmáticas con canalículos expresando el canal de agua AQP-8::mCherry bajo el promotor de aqp-8 . (C) imágenes adquiridas en baja magnificación resolución un patrón de "granos en cadena" corresponden a várices de fase específica (várices son depósitos abundantes vesículas con canalículos y otros componentes requeridos para el crecimiento de canal), pero no resolver citoplásmico puncta AQP-8. (D) imágenes adquiridas en mayor magnificación resolución puncta AQP-8 en el citoplasma de la canal, correspondiente a vesículas con canalículos. Barras de escala: 20 μm en C y 5 μm en el D. Todos los paneles muestran proyecciones confocales de secciones de 10 a 15 cada uno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Puntuación potenciadores y supresor des de un fenotipo de conducto enquistado (ERM-1[++]) por microscopía de disección
ERM (A) -1 [++]; rol-6(su1006) canales excretores se visualizan expresando GFP bajo un promotor vha-1 . Canales posteriores se extienden hasta la vulva o medio cuerpo del animal (flechas; considerado como extensión de 1/2) con un aumento menor (1.5 X objetivo y zoom baja). (B) a mayor aumento, el canal prensado pequeño enquistado firma ERM-1 [++] se pueden resolver, con la punta de los canales posteriores (un brazo indicado por la flecha pequeña) que se extiende hasta la vulva o un poco más allá (vulva indicada por la flecha grande; canal Lumen en panel D puede considerarse como tipo de comparación). (C) supresión, ampliación baja: alargados y delgados canales en ARNi trataron animales de ERM-1 [++]. (D) a mayor aumento, canales posteriores pueden verse a extender casi totalmente a la cola (flechas pequeñas en comparación con el de los parentales, que se muestra en el panel B); la flecha grande indica posición de la vulva. (E) mejora: más acortados canales con grandes quistes en ARNi trataron animales de ERM-1 [++]; Ampliación baja, sin zoom. (F) a mayor aumento, extensión de canal posterior puede ser determinado como menos de 1/2 (flecha pequeña) o no se extendió hasta la vulva (indicado por flecha grande) y el tamaño del quiste como superior a 1/3 del ancho del animal (más amplio que el del animal padre que se muestra en B). Barras de escala = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Análisis visual de la morfología del Canal excretor y componentes subcelulares de la Canal en animales mutantes/ARNi mediante Microscopía Confocal
(A – D) Distinguir un vacuolar de un fenotipo de conducto enquistado (superposición de confocal/DIC se muestran micrografías). (A) el citoplasma de un canal de tipo salvaje se visualiza expresando GFP bajo el promotor sulp-5 (pseudo-coloreado al azul en la distinción de la membrana apical de etiquetado, se muestra en verde en el panel B). (B) la membrana apical de un canal de tipo salvaje es visualizada por expresar ERM-1::GFP; cuenta que luz no es visible en esta ampliación y solo etiquetado no puede distinguir citoplásmicos de membrana etiquetado. (C) fenotipo canal excretor inducida por ARNi: etiquetado citoplasmática no puede distinguir entre vacuolas citoplásmicas intralumenal quistes. (D) fenotipo canal excretor inducida por ARNi: Apical ERM-1::GFP etiquetado detecta acumulación de líquido dentro del lumen, identificación de los quistes (lumenal) en lugar de las vacuolas (citoplásmicas) (Comparar con figura 4I de vacuolas citoplásmicas). Barra de escala = 40 μm para A – D, se muestra en a. análisis (E, J) efectos de pérdida y ganancia de función en componentes subcelulares canal (se muestran imágenes confocales de brazos de canal único). (C-e-G) Efecto de erm-1 ARNi en la localización subcelular de canalículos. Citoplasma de canal de tipo salvaje (E) ; Observe la luz indicadora de la exclusión de GFP. (F) tipo citoplásmico AQP-8::GFP puncta, corresponden a vesículas con canalículos. (G) citoplásmicos y desplazamiento basal de puncta AQP-8::GFP en erm-1(RNAi) animal. Luz discontinua (H) y detalle de la patología de punta de lumen (curling y la pérdida de luz centrado) en erm-1(mildRNAi) animal (ver3 para modulación de fuerza de RNAi); Tenga en cuenta que citoplasma de canal se extiende más allá de la punta de la luz, indicada aquí por pequeños quistes. (I) vacuolas citoplásmicas en cuerpo canal excretor sin ninguna extensión de canal en afectaron erm-1(RNAi) animal3; Tenga en cuenta que no es acto 5::GFP reclutó a la luz (excepto varios pequeños puntos alrededor de algunas vacuolas). (J) contratación de ley 5::GFP y AQP-8::mCherry a la luz de la triple animal transgénico overexpressing ERM-1 (cinturón grueso nota de ley 5::GFP y grupos de AQP 8::mCherry superpuestas alrededor del lumen quístico). Barra de escala = 5 μm para E, J, en E. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Ejemplos de cuantificación de los defectos del Canal por microscopia Confocal y disección
(A) representación esquemática del tipo salvaje (panel superior) y mutante enquistado (paneles inferiores) canales excretores para la cuantificación del tamaño de longitud y quiste de canal. Longitud del canal posterior se cuantifica como 0, 1/4, 1/2, 3/4 y 1. Longitud de canal '0' no indica extensión y '1' indica extensión de larga duración. Tamaño del quiste es cuantificado como < 1/3 (pequeño) y > 1/3 (grande) del diámetro del cuerpo. (B) cuantificación de la morfología del canal bruto en control y ERM-1 [++](ARNi) animales por disección microscopía fluorescente. En los simulacros(ARNi) ERM-1 [++] animales, la longitud del canal posterior es aproximadamente 1/2 en 95% los animales (imagen de referencia, Figura 3A-B). En animales de supresor de ERM-1 [++](RNAi) , longitud del canal posterior se extiende casi totalmente en los 80-90% de animales (imagen de referencia, figura 3– D). En animales de ERM-1 [++](ARNi) potenciador, aproximadamente 60-70% de canales con quistes grandes y una longitud más corta (< 1/2) (imagen de referencia, figura 3E-F). Datos presentados como media ± SD (n > 3). (C) cuantificación de la intensidad de la fluorescencia del citoesqueleto canal apical/lumenal de ImageJ de imágenes confocales. Membrana apical del canal está etiquetada por ley 5::GFP, brazo tipo canal se muestra en el brazo izquierdo, canal de ERM-1 [++], a la derecha. Paneles a la izquierda: intensidad del acto-5::GFP en manga de membrana de tipo salvaje es cerca de 50 (gris valor membrana; indicada por la flecha roja y negra), se muestra por debajo de la imagen de la trama. Paneles de la derecha: intensidad del acto-5::GFP en el Mer-1 [++] está por encima de 100 (valor gris de membrana dorsal es aproximadamente 110 (flecha negra), y de la membrana ventral es aproximadamente 140 (flecha roja)), se muestra debajo de imagen de trama. Barras de la escala = 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: ejemplos de los marcadores para el C. elegans Membrana Canal excretor
Nombre de la proteína Sub
localización celular Función Ejemplos de cepas disponibles Referencias ERM-1 dominio apical vinculador de membrana-citoesqueleto VJ402 (fgEx13 [erm-1p::erm-1::gfp, rol-6p::rol-6(su1006)]) Ref (13) ACT-5 dominio apical actina localizada apicalmente VJ268 (fgEx12[(act-5p::act-5::gfp), unc-119 (+), unc-119 (ed3) III]) Ref (13) ABTS-2 Basolateral Transportador de aniones/bicarbonato ABTS-2::GFP Ref (42) SULP-8 Basolateral Sulfatepermease SULP-8::GFP Ref (42) VHA-1 vesículas con canalículos V-ATPasa VJ535 (fgEx35 (vha-1p::vha-1::gfp; rol - 6P:: rol-6(su1006))) Ref (9) VHA-5 vesículas con canalículos V-ATPasa ML846 (vha-5(mc38) IV; mcEx337 [vha-5 (+):: GFP + rol-6(su1006)]) Ref (10) AQP-8 vesículas con canalículos Aquaporin, canal de agua VJ533 (fgEx33 (aqp-8p::aqp-8::gfp)) Ref (9) RAB-5 endosomal vesículas trata de personas BK209 (qpIs99 (exc9p::mCherry::rab-5)) Ref (36) RAB-7 endosomal vesículas trata de personas BK210 (qpIs100 [Pexc-9::mCherry::rab-7]) Ref (36) RAB-11 endosomal vesículas trata de personas BK205 (qpIs97 (exc9p::mCherry::rab-11)) Ref (36) 1 Se seleccionan ejemplos de recursos listados en la tabla 3.

Tabla 2: ejemplos de C. elegans Excretory Canal específicos promotores
promotores Etapa de expresión
ERM-1 embriones de etapa comas
sulp-5 3-Fold embrión
VHA-1 embrión 2 veces
VHA-5 embrión 2 veces
AQP-8 embrión 2 veces
GLT-3 embrión de finales
1 Se seleccionan ejemplos de recursos listados en la tabla 3.

Tabla 3: recursos
Recursos para identificar moléculas de canal específicos excretor C. elegans, etiquetado cepas de reactivos y anticuerpos
1. Centro de genética Caenorhabditis (CGC)43 disponibles reactivos y cepas
2. Wormbase44 para obtener más información sobre moléculas específicas del canal excretoras, cepas y anticuerpos
3. información sobre moléculas específicas del canal excretoras: véase la referencia6
4. Transgeneome sitio Web45 para construcciones de la fusión de GFP traslacionales
5. C.elegans expresión patrón46 para construcciones de la fusión de GFP transcripcionales
6. nacional proyecto de BioResource (NBRP)::C.elegans47 para obtener información sobre los promotores y mutantes de C. elegans
7. fluoróforos: ver referencia48,49
Recursos web para el montaje de las moléculas de una biblioteca específica de ARNi
1. GeneMANIA50
2. AceView51
3. iHOP52
4. Wormbase44
5. saccharomyces genoma base de datos53
6. Flybase54
7. ratón genoma base de datos55
8. genoma base de datos56
9. alto57

Tabla 4: Ejemplo de fenotipo Simple hoja de puntuación
Biblioteca de ARNi Cepa General fenotipo (% total) Fenotipo de canal
Longitud del canal < 1/2 (% L4) Longitud del canal > 1/2 (% L4) Otro fenotipo de Canal Número total de animales contados
La placa No Número de pozo
I-1 A1 ERM-1 [++]; VHA - 1P:: GFP CLR (30) 80 20 100
X-5 B12 mismo ninguno 30 70 100
III-10 C5 mismo UNC (54) 70 30 quistes grandes 100

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Discussion

Versatilidad genética de C. elegans , transparencia, plan de cuerpo simple y linaje de la célula de referencia hacen un excelente modelo para el análisis de la morfogénesis. Este protocolo describe cómo combinar manipulación genética estándar e imagen estudios para tomar ventaja de los 2 micrones delgado canales excretores C. elegans para estudiar la membrana polarizada y biogénesis de lumen intracelular en un tubo de la célula.

Etiquetado
Los canales excretores de C. elegans pueden ser etiquetados por la expresión de proteínas fluorescentes de fusión, permitiendo análisis vivo (descrito aquí), o por anticuerpos o tinción química (véase el acompañamiento de papel en tubulogenesis intestinal para la tinción de anticuerpos 3). la expresión de dos o más diferentes fluoróforos o la combinación de estos diferentes técnicas, de etiquetado permite una disección visual de alta resolución de estos túbulos delgados (figura 2). Proteínas fluorescentes de fusión dirigidas a los canales por un promotor específico del canal son la primera opción para el canal excretor etiquetado por varios motivos, entre ellos: (1) los niveles de baja expresión de muchas proteínas de canal y estructura de fina (2) del canal que es fácilmente abrumado por la coloración fuera de los canales donde se puede expresar también la proteína de interés. Por otra parte, canales son sensibles a proteínas exógenas y desarrollar fácilmente fenotipos inespecíficos (p. ej., extensión defectos y quistes o incluso mortalidad) cuando estas proteínas se expresan fuertemente. Esto debe pesar en la decisión al elegir entre diferentes formas de generación de animales transgénicos. En principio, los transgenes pueden introducirse como matrices extracromosómicos (por ejemplo, por inyección directa de ADN del plásmido en la gónada para la transformación de la línea germinal, como se describe aquí), que normalmente genera matrices número copia alta (a menudo con alta expresión), o integrado en el genoma, por lo general en número de copia baja o simple (por ejemplo, por bombardeo26 o a través de copia única Mos1-mediada inserción [MosSCI]27). Extrachromsomal matrices también pueden integrarse en el genoma en un segundo paso (todavía, sin embargo, en un número de copia alta)18. Por otro lado, cuando se inyecta en la línea germinal en baja concentración (por ejemplo, 1 – 2 ng/μl de ADN, combinado con una mayor concentración de marcador de ADN), arreglos de discos de número bajo (incluso única) copia pueden ser fácilmente generado28. Este escenario tiene la ventaja que se pueden variar las concentraciones de ADN, que puede ayudar a encontrar el mejor nivel de expresión para el etiquetado de canal, ni demasiado bajo ni demasiado alto (tóxico). La relación entre el nivel de concentración y expresión ADN inyectado depende de múltiples factores (p. ej., el promotor) y así debe ser determinada empíricamente. Alternativamente, el gen de interés puede ser directamente etiquetado con un fluoróforo en el germline agrupadas regularmente entremezclado corto palindrómico repite (CRISPR) basado en procedimientos de etiquetado29,30. Aunque este enfoque coloca el fluoróforo en su contexto genómico más fisiológica, no siempre es necesario o incluso deseable (por ejemplo, cuando la proteína se expresa en niveles muy bajos). Sin embargo, puede, ser la mejor opción, por ejemplo si el gen de interés es muy grande.

Visualización de canal puede lograrse orientando construcciones transcripcionales en el canal que pondrá de relieve el citoplasma del canal por un fluoróforo. Por el contrario, etiquetado de componentes subcelulares canal requiere una fusión translacional donde está conectado el gene de cuerpo entero en marco al fluoróforo gene de codificación. Cuando se utiliza un promotor específico de canal de expresión (algo que el promotor del gen), su elección debe basarse en la fuerza del promotor y, para el análisis del desarrollo, el momento de su expresión. Muchos genes específicos del canal excretor no expresan antes de la etapa larval cuando función osmótica del canal se convierte en crítica; demasiado tarde para el análisis de su fase de extensión activa (erm-1 y pros-1 son genes expresados principios)10,13. Ejemplos de marcadores del canal excretor endo - y membranas del plasma y de promotores específicos del canal se dan en las tablas 1 y 2, respectivamente y los recursos para la búsqueda de moléculas específicas de canal adicionales en la tabla 3. Estos recursos también pueden utilizarse para encontrar una proteína de fusión fluorescente adecuado ya hecho, que puede estar disponible a través del centro de genética de Caenorhabditis (CGC; ver también tabla 1). Para la construcción de plásmidos recombinantes para la expresión de tales fusiones de proteína, se pueden utilizar varios métodos de clonación, cada uno con específicas pros y contras (discutido en otra parte14). Se trata de enzimas de restricción convencional basado en enfoques, descritos aquí de clonación, clonación modular utilizando el multisite Gateway sistema31, Asamblea de Gibson32o reportero gene construcción por el método de "PCR costura"14 ,33. Estos diferentes enfoques se pueden adaptados al método seleccionado para su introducción en la línea germinal o a otras necesidades específicas (por ejemplo, el Gateway versátil sistema facilita arrastrando los pies de los promotores y cDNAs para mayor escala etiquetado enfoques) . El cuidado necesita ser tomado para elegir el sitio de inserción correcta para el fluoróforo (enlace en la N-y c-terminal de la proteína), teniendo en cuenta la función de la proteína de interés.

Interferencia con la función del gen
Como una de muchas posibles formas de perturbar la función génica en C. elegans, este protocolo describe una pantalla específica de interacción ARNi diseñada para modificar un fenotipo de lumen quístico canal, inducido por overexpressing un componente de la membrana lumenal. En este caso, overexpressing una membrana apical/lumenal marcador asociados tales como ERM-1 tiene la ventaja de orientar directamente la consulta en el destino deseado: el análisis de la biogénesis de la membrana apical/lumenal intracelular. Un fenotipo de ganancia de función generado por sobreexpresión también proporciona ciertas ventajas cuando se combina con una pantalla de interacción (ARNi) de pérdida de función como se describe aquí (ver34 para la discusión de los análisis de pérdida y ganancia de función y la diseño de pantallas, genéticas). Por otra parte, ERM-1 sí mismo es un bien investigado "lumen morfogénesis" y membrana apical identidad molécula12. Por lo tanto, en este caso, una pantalla específica (más que objetiva) es probable que directamente informativo para la morfogénesis de la luz mientras que concomitante de más caracterización ERM-1 función específica en este proceso. Sin embargo, una pantalla de orientada a no imparcial podría llevarse a cabo de manera similar, a partir ya sea con un animal de tipo salvaje, un animal transgénico con fluorescently etiquetado de canales excretores, o con cualquier mutante de canal. El general ventajas y desventajas de RNAi (p. ej., versus mutagénesis) para la generación de fenotipos de pérdida de función y la conducción y la discusión de diferentes tipos de pantallas de la genéticas en C. elegans se discuten en otra parte 34. ARNi produce un espectro de fenotipos, entre fenotipos más leves, una ventaja específica para el análisis de los genes tubulogenesis a menudo letal. Esto es descrito y discutido en el documento de acompañamiento en la tubulogenesis intestinal3. Diferentes enfoques para generar ganancia y pérdida de función mutantes y procedimientos genéticos clásicos tales como cruces, son detallados y discutidos en los métodos de genética general literatura20.

Microscopía y la evaluación de fenotipos tubulogenesis
Evaluar visualmente y anotando la modificación de un fenotipo bien definido canal bajo un fluorescente microscopio de disección utilizando parámetros de puntuación simple (como canal longitud y luz de diámetro), como se describe aquí, se pueden lograr en un corto período de tiempo incluso cuando se procesa un gran número de animales en una específica y sistemática genéticos o pantalla de RNAi. En cambio, una pantalla similar buscar fenotipos de morfogénesis novela canal en una cepa que es tipo salvaje (a excepción de su etiquetado de canal del transgén), es que más tiempo consume, pero puede, en principio, se realiza de la misma manera (tal hemos realizado un pantalla en forma de genoma en varios meses). Tales pantallas identificará múltiples fenotipos diferentes canal (no mostrados aquí) y por lo tanto debe desarrollar paralelamente diferentes parámetros de puntuación, por ejemplo, una clasificación cualitativa (ver 9,11, un esquema de 35,36,37,38 formas diferentes de puntuación canal fenotipos por microscopía de disección). Al interpretar cualquier fenotipo de canal, es crucial tener en cuenta que la formación del quiste puede ser un efecto inespecífico de muchos insultos diferentes a esta estructura tubular delgadita, y es a menudo un fenotipo terminal menos informativo. Tamaño del quiste y la ubicación, por el contrario, pueden ser informativos, por ejemplo, un quiste cerca de la célula del canal (en el comienzo de la extensión del canal), quistes a lo largo de la longitud del canal o quistes en punta canal, proporcionan pistas sobre el mecanismo subyacente de los defectos. Quistes del canal (aquí definidos como intra-lumenal esferoides llenas de líquido rodeadas por una membrana apical/lumenal) deben distinguirse de las vesículas (pequeñas citoplásmico membrana-limite líquido llenado esferoides) o vacuolas (agrandamiento citoplásmico membrana-limite esferoides llenados líquidos), no rodeado por una membrana lumenal, que pueden todos mirar superficialmente idénticos (Figura 4A-D). Vacuolas citoplásmicas además pueden presentarse secundario, por ejemplo, a través de los efectos tóxicos de montaje soluciones (azida de sodio). Tanto, los quistes grandes y vacuolas citoplásmicas pueden tomar casi del tamaño del animal y que se distingue de la clásica "borrar (Clr)" canal fenotipo causado por acumulación de líquido en la cavidad del cuerpo. Por último, canal longitud casi siempre secundario está comprometido en canales enquistadas, por lo tanto un defecto de extensión de canal verdadero debe ser demostrada en un entorno libre de quiste.

A pesar de su pequeño diámetro, componentes subcelulares de excretorio canales, tales como apical versus las membranas basales, intracelulares endosomal versus con canalículos vesículas, orgánulos intracelulares y componentes del citoesqueleto, puede visualizarse por mayor Ampliación, por ejemplo, microscopía confocal (figura 2, figura 4). Por proyección de imagen confocal, un citoplasma de canal positivo de GFP solo es suficiente para distinguir la luz del citoplasma de canal a través de una línea no fluorescente (figura 2A, figura 4E). La identidad de los marcadores contribuye a resolver con canalículos de endosomal vesículas (también sorprendentemente diferentes en tamaño), aunque la asignación definitiva requerirá immunoelectronmicroscopy39. Dobles y triples de etiquetado puede determinar la localización subcelular de una molécula de interés y la relación de componentes subcelulares entre sí (figura 2). Solo canal lumenal etiquetado membranas producen la misma línea de doble que el citoplasma o membrana basal, pero pueden distinguirse mediante doble o triple de etiquetado. Para el análisis confocal, montaje correcto es importante, dada la fragilidad de la estructura del canal, su sensibilidad a los cambios osmóticos y la vulnerabilidad de su fenotipo quística más frecuente. Quistes estallan fácilmente a cambios osmóticos o presión física, son sensibles a las toxinas de membrana como la azida de sodio y también son sensibles a algunos anestésicos utilizados para la inmovilización (que puede también producir vacuolas citoplásmicas). En nuestras manos, lidocaína 5% en buffer M9 funciona mejor para los ensayos de canal excretores más. Procedimientos de proyección de imagen y toda la gestión deben ser suaves, como se describe. Para evitar artefactos que imitan los fenotipos (p. ej., quistes y vacuolas), es mejor adquirir inmediatamente imágenes después del montaje. Si no es posible, imágenes de quiste se deben adquirir en primer lugar, antes de la proyección de imagen otros fenotipos. Este protocolo analiza estándar microscopía confocal que proporciona confocality superior, en comparación con el spinning microscopia confocal de disco que, por el contrario, reduce la fototoxicidad y es la microscopia de elección para el análisis de los cambios dinámicos de componentes subcelulares en el tiempo. Tales preguntas sobre la dinámica subcelular pueden también abordarse utilizando técnicas de fotoblanqueo o etiquetado proteína de fusión con fluoróforos foto conmutable que cambian de color40. Por último, la gama de la resolución puede aumentarse aún más mediante la adición de microscopía electrónica de transmisión (TEM, proporcionando la más alta resolución estructural pero no molecular), microscopía de superresolución (proporciona la resolución molecular en el rango del nanómetro); o immunoelectronmicroscopy (siempre ambos)39,41. Tomografía 3D puede combinarse con secciones serie de TEM y es particularmente útil para el análisis de la interfaz de la membrana de plasma con canalículos de canales excretores9,10. Técnicas mejoradas de estos diferentes tipos de microscopía y combinaciones de estos diferentes enfoques de seguirán desarrollándose.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Agradecemos a M. Buechner (Universidad de Kansas, Kansas, EEUU), K. Nehrke (centro médico de la Universidad de Rochester, Rochester, Nueva York, Estados Unidos) y el centro de genética de Caenorhabditis , financiado por los institutos nacionales de salud, oficina de infraestructura de investigación Programas (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por subvenciones NIH GM078653, MGH es 224570 223809 SAA a V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference19 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference19 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference19 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference21 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref21,58,59) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref60) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)

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El Canal de Excretory <em>C. elegans</em> como modelo de morfogénesis Lumen intracelular y <em>En Vivo</em> biogénesis de la membrana polarizada en una sola celda: etiquetado por fusiones de GFP, ARNi interacción pantalla e imagen
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Zhang, N., Membreno, E., Raj, S.,… More

Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).

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