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1. FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR Graciela M. Escandar

2. FLUORESCENCIA luz incandescente luz ultravioleta

3. FOSFORESCENCIA 1:00:00 1:00:30 1:10:40

4. RELAJACIÓN NO-RADIANTE LUMINISCENCIA ABSORBANCIA S2 S2 S1 S1 So So singlete* triplete* singlete

5. Fluorescencia molecular Es un proceso de fotoluminiscencia en que las moléculas se excitan por absorción de radiación electromágnética. La especie excitada posteriormente se relaja hasta el estado fundamental, con la liberación de su exceso de energía en forma de fotones

6. DIAGRAMA DE ENERGÍA (Jablonski) RV CI S2 CS S1 T1 ENERGíA ABSORCIÓN F CE P S0 2 1 4 3

7. Factores que influyen en la señal fluorescente tipo de transición concentración estructura LUMINISCENCIA EN SOLUCIÓN solvente pH temperatura apagadores químicos

8. estructura p* p p* n C H2 Factores que influyen en la señal fluorescente tipos de transición Compuestos aromáticos, estructuras con dobles enlaces conjugados, anillos aromáticos fusionados. Rigidez. Sustituyentes bifenilo fluoreno

9. solvente Factores que influyen en la señal fluorescente Efectos generales y específicos Su aumento, disminuye la intensidad de fluorescencia por aumento de probabilidad de conversión externa temperatura

10. N N H H H H H H H H H + N N + anilina Factores que influyen en la señal fluorescente La fluorescencia de compuestos aromáticos con propiedades ácido-base es generalmente pH-dependiente pH ion anilinio apagadores químicos Apagamiento dinámico y estático

11. BANDAS DEL ESPECTRO F EXCITACIÓN EMISIÓN Corrimiento de Stokes l

12. S1 S0 BANDAS DEL ESPECTRO F RAYLEIGH F RAYLEIGH 2° orden RAMAN RAMAN 2° orden l RAMAN RAMAN RAYLEIGH

13. IF/IA  = ANÁLISIS CUANTITATIVO  =No fotones emitidos/No fotones absorbidos IF = IA= = (Io – IT) = = Io (1– IT/Io) = = Io (1 – e-2.303bC) = IF=Io (1 – e-kbC)

14. Recordando que: x x2 x3 1! 2! 3! si x es muy pequeño: e-x = 1-x - - e-x = 1 + ANÁLISIS CUANTITATIVO IF=Io (1 – e-kbC) IF = Io (1– 1 + kbC) = Io kbC IF = KC K

15. F C ANÁLISIS CUANTITATIVO IF vs C (a bajas concentraciones de analito) IF = KC

16. ESPECTROFLUORÍMETRO monocromador M fuente atenuador del haz monocromador fotomultiplicador de muestra fotomultiplicador de referencia amplificador dispositivo de lectura

17. OBTENCIÓN DE ESPECTROS DE EXCITACIÓN Y EMISIÓN F EXCITACIÓN EMISIÓN l 1)Obtención del espectro de absorbancia para determinar la longitud de onda de absorción 2) Fijar el monocromador de excitación a esta l y obtener el espectro de emisión 3) Fijar el monocromador de emisión a la l seleccionada en el punto 2 y obtener el espectro de excitación.

18. Si kbC es grande (absorbancia 0.02) IF =Io [kbc – (kbc)2 (kbc)3 ... - ] + 2 6 F C CAUSAS DE DESVÍO DE LINEALIDAD IF =Io (1 –e-kbC) Término lineal Lineal+cuadrático+cúbico Lineal+cuadrático

19. FILTROINTERNO Afecta la linealidad de la curva de calibrado y el perfil de los espectros de excitación y/o emisión Producido por el propio analito (alta concentración) • Variación de potencia de luz incidente en el trayecto • Autoapagamiento • Autoabsorción Producido por otra sustancia - Sustancia que absorbe en la región de l de excitación o emisión del analito

20. Detección de la emisión FILTROINTERNO Alta concentración: la emisión disminuye en el trayecto de la luz incidente Baja concentración: emisión uniforme Excitación Detección de la emisión

21. F F ppm ppm 100 200 300 0 2 4 6 8 10 Curva de calibración de sulfato de quinina Linealidad Filtro interno Término cúbico o mayor