Desafíos para avanzar a un control efectivo de la Piscirickettsiosis

Marcos Mancilla y Patricio BustosLaboratorio de Diagnóstico y Biotecnología, ADL Diagnostic Chile Ltda. Dirección: Sector La Vara s/n, camino Alerce, casilla 160, Puerto Montt mmancilla@adldiagnostic.cl

La Piscirickettsiosis o Septicemia Rickettsial del Salmón (SRS), enfermedad infecciosa producida por la bacteria Gram-negativa Piscirickettsia salmonis, se manifiesta en salmónidos como un cuadro agudo o subagudo de alta letalidad, factible de expresarse durante toda la fase de engorda en agua de mar (1). Aunque la enfermedad fue inicialmente diagnosticada en salmón Coho (2, 3) en la región de Los Lagos, poco tiempo después comenzó a afectar a las tres especies de salmónidos en cultivo, diseminándose a todas las regiones en que se realiza engorda, pero con pérdidas focalizadas en las regiones de Los Lagos y Aysén, no así en la de Magallanes, en donde la presentación tiene diferencias notables a la fecha. Según recientes estadísticas entregadas por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura (Sernapesca), la Piscirickettsiosis fue responsable de casi un 80% de las mortalidades ocurridas por enfermedades infecciosas en el primer semestre del 2014 (4). Sin embargo, no sólo las pérdidas económicas asociadas con esta enfermedad se traducen en mortalidades, pues hay que sumar los costos generados por los tratamientos con antimicrobianos, campañas de vacunación, reducción del peso y morbilidad de individuos, efectos en la calidad del producto final, entre otras. Un catastro inicial cifró en US$ 100 millones las pérdidas directas (5). No obstante, según antecedentes discutidos en otras instancias, este valor estaría muy por debajo de las pérdidas reales actualizadas producto de esta enfermedad. Las estimaciones anteriores señalan a P. salmonis como un patógeno que afecta de modo importante la sustentabilidad y el desarrollo futuro de la industria salmonicultora chilena. Para desarrollar un plan eficaz de prevención y control de cualquier enfermedad infecciosa, se requiere del conocimiento del agente patógeno desde diversos ángulos, lo que en término generales podríamos denominar como su biología. P. salmonis es una bacteria nutricionalmente exigente y de crecimiento lento. Esta característica impone dificultades técnicas en el momento del aislamiento y posterior caracterización de los aislados, lo que impacta negativamente en el avance del conocimiento del agente. De hecho, el desarrollo de los primeros medios de cultivo libres de células capaces de permitir el crecimiento de P. salmonis (6, 7) tomó alrededor de diez años. Lo anterior modificó no solamente la etiqueta de patógeno intracelular obligado, dada inicialmente, sino también posibilitó la determinación de la secuencia del genoma. Recién en 2013, se reportó el primer borrador de la cepa tipo LF-89 (8). A este trabajo, se sumó luego la secuencia de una cepa virulenta denominada Austral-005 (9) y un trabajo comparativo que dio cuenta de dos aislados genómicamente diferentes (10). De acuerdo con lo anterior, estamos en la era post-genómica de la investigación de la Piscirickettsiosis, la cual debería tener como eje central estudios funcionales orientados a explicar la naturaleza patogénica de P. salmonis. La investigación epidemiológica ha jugado desde siempre un papel muy importante en la formulación de los programas de prevención y control de enfermedades infecciosas (11) y, desde esta perspectiva, la base que entrega la epidemiológica molecular es de fundamental relevancia. Esta disciplina, que emergió de la integración de la biología molecular en la investigación epidemiológica tradicional, se enfoca en el estudio de la contribución de los factores de riesgo potenciales, ya sean estos genéticos o ambientales identificados a nivel molecular, sobre la etiología, distribución geográfica y prevención de enfermedades dentro y entre poblaciones (12). La elección del método molecular para genotipificar, está influida por el tipo de pregunta a responder, del grado de diversidad genética de la especie a ser analizada y de los mecanismos responsables de la generación de dicha diversidad. Entre ellos, la electroforesis en gel de campo pulsado o PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) y la tipificación de secuencias multi-locus o MLST (multi-locus sequence typing) son algunos ejemplos de metodologías aplicadas para el estudio de diversos patógenos acuáticos (13-15). Estudios de este tipo, que darían cuenta de la diversidad de la población de P. salmonis, no han sido reportados. La información disponible, orientada más bien a establecer relaciones filogenéticas, se basa en tamaños de muestra muy reducidos (16, 17). En esta línea, recientemente se publicó un análisis comparativo de secuencias que sugiere la presencia de cepas con genomas diferentes de P. salmonis (10). Estas cepas serían representativas de dos genogrupos denominados arbitrariamente A (tipo EM-90) y B (clásica, tipo LF-89) que no solamente representan genotipos distinguibles, sino además, tendrían rasgos fenotípicamente distintivos, como la preferencia de hospedero, virulencia, fenotipo de colonias y susceptibilidad antimicrobiana (Tabla 1), entre los principales.

A pesar de los continuos esfuerzos realizados por distintos grupos de investigación, existen brechas de conocimiento que impactan negativamente en el desarrollo de nuevos productos para el control de la Piscirickettsiosis: i) La escasez de información genética de la bacteria. En bases de datos sólo hay disponibles secuencias parciales de distintas cepas. Esto dificulta los análisis comparativos. Además, como se mencionó más arriba, estudios de genotipificación son escasos y no dan cuenta de la diversidad de las cepas circulantes actuales. ii) Estudios acerca de los mecanismos de patogenicidad. En este punto, se reportó muy recientemente la expresión de genes homólogos de Legionella pneumophila que codifican proteínas asociadas con virulencia (18), así como también genes que codifican para componentes de sistemas de secreción de tipo IV (19). Una exotoxina de origen peptídico (20) y la formación de biofilm (21) también han sido descritas. La estructura del lipopolisacárido, antígeno inmunodominante, se determinó recientemente (22). No obstante, prevalece la escasez de estudios enfocados a la interacción hospedero-patógeno. iii) La disponibilidad de herramientas de manipulación genética. Se ha especulado que P. salmonis es refractaria a la introducción de material genético exógeno debido a la presencia de plásmidos (23), por lo tanto, las tecnologías de mutagénesis basadas en vectores plasmidiales no podrían aplicarse a la bacteria, lo que impide hasta ahora la realización de estudios funcionales más profundos. iv) Falta de un criterio uniforme para determinar susceptibilidad a los antibióticos. Paradójicamente, el desarrollo tardío de medios de cultivo (24-26) estimuló a los laboratorios diagnósticos a utilizar formulaciones caseras, las cuales comparativamente no difieren significativamente respecto de los parámetros de crecimiento reportados (resultados no publicados). Sin embargo, no existe un estudio transversal comparativo que indique cuál(es) medio(s) serían los apropiados para las pruebas de susceptibilidad, con excepción del medio Austral-SRS (27). Una arista importante para el control de la Piscirickettsiosis, la profilaxis, desafortunadamente no se ha resuelto de forma eficiente con el uso de vacunas basadas en antígenos inactivados, ya sea mediante productos monovalentes, o bien formando parte de formulaciones con múltiples antígenos. En Chile, existen a la fecha 35 productos biológicos aprobados con registro provisional para la prevención del SRS (28). A pesar de la disponibilidad y el uso continuo que se le ha dado a estos productos, no existe un consenso respecto de su eficacia en condiciones de campo (29). En contraste, más bien existe consenso respecto de que la eficacia de las vacunas es sólo parcial, cubriendo al parecer un tiempo limitado, mucho menos del necesario. En efecto, un análisis epidemiológico reciente sugiere que algunas de estas vacunas no reducen la mortalidad acumulada producida por SRS, sino más bien retrasarían la aparición del primer brote (30). Es más, en dicho estudio tampoco se encontró una diferencia significativa entre la velocidad de mortalidad anterior y posterior a la aplicación de la vacuna en algunos centros seleccionados. Dados los limitados resultados de campo mostrados por las vacunas, el control de la Piscirickettsiosis ha recaído principalmente en las terapias antimicrobianas. Sólo en 2013, según cifras oficiales, se consumieron más de 450 toneladas métricas de antibióticos (31), lo cual deja en evidencia la disparidad en el uso de estas moléculas respecto de Noruega, país que ocupó menos de una tonelada en igual periodo. De esta cantidad, casi el 80% se destinó a los tratamientos de brotes de Piscirickettsiosis. Por lo tanto, podemos establecer fehacientemente que la responsable directa del alto consumo de antibióticos por la industria es precisamente P. salmonis.

El uso intensivo de antibióticos puede traer otros problemas, como por ejemplo la selección de cepas bacterianas resistentes, sean estás ambientales o patógenas. Un ejemplo bien documentado es la resistencia a quinolonas, cuya forma más frecuente se manifiesta por mutaciones que afectan genes que codifican para la girasa, una enzima esencial para la replicación del ADN (32). De acuerdo con lo anterior, el surgimiento y diseminación de cepas de P. salmonis resistentes se proyecta como una amenaza real. De hecho, un artículo reciente describió una mutación espontánea en un gen esencial para P. salmonis denominado gyrA, la cual estaría asociada con la resistencia a las quinolonas (33). Esta investigación ha dado pie a profundizar en la prevalencia de la mutación en una colección representativa caracterizada fenotípicamente, encontrándose en un 52% del total de aislados analizados (n=292) y en un 100% de los aislados resistentes a ácido oxolínico y flumequina mediante un ensayo de PCR diseñado para tal efecto (34). Probablemente, la selección y diseminación de cepas que contienen la mutación hasta hoy, obedeció a los tratamientos prescritos a base de quinolonas, las cuales representan en la actualidad un insignificante a nulo uso (35). En este contexto, insistimos en la necesidad de estudios extendidos que incluyan un número de aislados representativo de la población de P. salmonis, para así determinar aquellos puntos de corte de concentraciones de antibióticos que permitan una descripción precisa de los fenotipos resistentes. Resultados de estudios ambientales preliminares han identificado genes responsables de resistencia a florfenicol (FLO) (36) y oxitetraciclina (OTC) (37) en bacterias ambientales aisladas de muestras de agua de pisciculturas y centros de mar. Si bien lo anterior podría significar una fuente potencial de transferencia horizontal de genes de resistencia, también es cierto que no hay evidencia científica disponible que relacione la presencia de estos marcadores y la aparición de cepas resistentes de P. salmonis. Es más, bien podría darse el hecho de que estas bacterias ambientales hayan mantenido este patrón por muchos años sin la intervención de antibióticos y representen un patrón original salvaje en donde no hay influencia histórica de los antibióticos; esto puede ser también factible, pero se entiende que es tentador relacionar esos resultados con el uso de antibióticos. No obstante, mientras no haya evidencias científicas claras, creemos necesario exponer no sólo una parte sino todas las explicaciones posibles. Además, es importante destacar que los mecanismos de resistencia para FLO y OTC en P. salmonis permanecen sin aclarar, lo que dificulta la aproximación molecular para la identificación de marcadores asociados. Por ello, será necesario primero identificar y caracterizar cepas de campo resistentes, secuenciar y realizar estudios genómicos comparativos con secuencias de cepas susceptibles, lo que permitirá, a su vez, la identificación de dichos marcadores. En resumen, a pesar de que el actual escenario en materia de control de SRS se ve complejo, nos mostramos optimistas respecto de un cambio en el mediano plazo, y las razones que sustentan este planteamiento dicen relación con al menos siete elementos que necesariamente modificarán los patrones de conducta de la enfermedad y la inmunocompetencia de los peces. Nos referimos a: 1) La generación de poblaciones genéticamente resistentes a SRS, cuyos estudios en curso muestran resultados promisorios. A modo de ejemplo, recordemos que en Noruega la curva de incidencia de IPN sufrió una inflexión evidente, no cuando aparecieron en el mercado las vacunas, sino cuando comenzaron a sembrarse los centros de engorda con smolts de salmón Atlántico genéticamente resistentes al virus (IPNv). 2) Vacunas más efectivas contra SRS. Se están desarrollando nuevas vacunas para afrontar el desafío que las actuales no han logrado satisfacer los requerimientos de la industria. Estas nuevas vacunas poseen cambios tecnológicos (versión que podríamos preliminarmente llamar 2.0), los cuales esperamos contribuyan a proteger mejor y por más tiempo a los peces. Estos productos deberían estar disponibles en corto plazo. 3) Mejoramiento de la bioseguridad. En este contexto, ha habido en los últimos años un gran avance en esta materia, lo que ha permitido tener éxito en el control de ISA, pero no lo suficiente para SRS dada su naturaleza. Sin embargo, hay aún importantes mejoras que pueden hacerse a partir de una mejor comprensión de la enfermedad y sus variables epidemiológicas, en especial todos aquellos aspectos asociados al ambiente y al hospedero. Un ejemplo de lo anterior es el uso práctico de información objetiva acerca de la hidrodinámica marina (corrientes) y su relación con la re-definición y manejo más eficiente de los barrios; hay mucho por hacer en esta materia aún. Otro elemento destacable es: 4) El desarrollo de dietas funcionales que incorporan nuevas tecnologías asociadas con un mayor conocimiento de la inmunidad de los peces, lo que debería agregar puntos a favor cuando se combinen e integren con las otras medidas. Otro elemento muy importante es: 5) El actual modelo productivo, el cual necesita ser analizado en detalle para identificar mejoras necesarias. La profunda reflexión y análisis respecto de cómo manejamos y producimos los peces, en todo su contexto y en todas sus etapas, nos permitirá hacer los cambios requeridos que contribuirán a mejorar el estado sanitario de los peces con enfoque en su bienestar. Es obvio que lo que hacemos hoy es perfectible y si bien hemos avanzado mucho en diversas materias, debemos abordar más críticamente ésta que es angular. Otro punto es que, no cabe duda que se ha escrito y dicho mucho acerca de: 6) la necesidad de contar con mayores recursos para la investigación y desarrollo en materia sanitaria, y que esos recursos sean bien invertidos. Por cierto, no podemos eludir la responsabilidad de manifestarnos muy de acuerdo con esa necesidad y adherirnos a los cambios que son necesarios hacer en esa materia, pero no sólo desde la perspectiva de que el Estado debe ser la única fuente de aportes, sino también la necesidad de que la industria bien organizada también lo haga, y para eso hay que mejorar nuestra forma de mirar las cosas. Finalmente, un aspecto no menor es que: 7) Contamos hoy con información científica objetiva, experiencia y tecnología que nos permiten, en tiempo real, conocer qué genovariante de P. salmonis es la que prevalece en el brote, así como predecir la resistencia/sensibilidad de la bacteria -y sus genovariantes- a los antibióticos mediante técnicas moleculares, lo que permite mejorar la gestión sanitaria, orientando mucho mejor la estrategia terapéutica, reduciendo indirectamente así el uso de antibióticos. Históricamente, sólo podíamos hacer esto cultivando la bacteria y ensayando in vitro la sensibilidad, lo que toma varias semanas, entregando finalmente resultados extemporáneos. Los estudios y desarrollos llevados a cabo por ADL Diagnostic Chile cambian esto dramáticamente, y los beneficios ya se están comenzando a advertir. Cabe señalar que el hallazgo de genogrupos (y subsecuentes genovariantes) creemos cambiará el enfoque epidemiológico que se le ha dado hasta ahora a la enfermedad, en el cual prevalece la idea de un único tipo de cepa predominante, diseminada y que afecta por igual a todas las especies en cultivo.

Sin duda, aunque la meta se vea aún un poco distante, el control efectivo de esta enfermedad no sólo traerá beneficios a la industria, sino también al medio ambiente, haciendo más sustentable una actividad económica prioritaria para el país. ¡Son éstas las razones por las cuales nos mostramos optimistas con el futuro! Referencias 1. Fryer JL, Hedrick RP. 2003. Piscirickettsia salmonis: a Gram-negative intracellular bacterial pathogen of fish. Journal of fish diseases 26:251-262. 2. Bravo S, Campos P. 1989. Coho salmon syndrome in Chile. American Fisheries Society Newsletter 17:3. 3. Fryer JL, Lannan CN, Giovannoni SJ, Wood ND. 1992. Piscirickettsia salmonis gen. nov., sp. nov., the causative agent of an epizootic disease in salmonid fishes. International journal of systematic bacteriology 42:120-126. 4. Sernapesca. 2014. Informe Sanitario Primer semestre 2014. 5. Cabezas M. 2006. Fármacos naturales en el cultivo de salmonídeos: una alternativa en el control de enfermedades. 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