Rev. Biol. Trop., 47(3): 419-427, 1999 www.ucr.ac.cr. WWW.ots.ac.cr www.ots.duke.edu Ausencia de detección de enterovirus en bivalvos Anadara tuberculosa (Bivalvia: Arcidae) p�����t��i�aciÓn química en-eTPaCílico(Je-CóstilRica- ------ Libia Herrero U.!, Alejandro Palacios F. 2, Laya Hun 0.1 y Francisco Vega A.l 1 2 Sección de Vrrología Médica, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica, Fax. 2252374. lherrero@sol.racsa.co.cr. Lousiana State University International Center of Medical 2060 Research and Training (LSU-ICMRT), San Jose, Costa Rica. japalaci@ns..etsalud.sa.cr..cl. San Jose, Costa Rica. _ Recibido 30-Vll-1998. Corregido l8-ill-1999. Aceptado 18-ill-1999. Abstract: Anadara tuberculosa is one of the most abundant mollusks of cornmercial importance in Costa Rica. Its habitat water is a potential source of fecal and chemical contamination to humans. We wanted to aSSeS enterovirus, 'mainIy poliovirus and hepatitis A virus and chemicals such as sulphates and nitrates in meat and body fluids. Thirteen samples were taken from four sites in Nicoya Gulf, three sites in the Sierpe�Térraba man­ grove (Pacific of Costa Rica) and from five fish markets in San José, the capital of Costa Rica. Sanrpllis were tested for 1) fecal coliforrns (Most Probable Number/100 rul), 2) isolation of enterovirus in cell culture (Hep"2, FrhK-4), 3) cell cytotoxicity in Vero cells and 4) the ability to inactivate 10 ID50% of poliovirus in cell cJllture. The Most Probable Number/100 rulin surrounding water was higher than j:he accepted standard for recreation­ al waters, although the number of fecal coliforrns in meats and body fluids was lower than in the external watér. No cytopathogenic agents were isolated, but we found nitrate and sulphate concentrations that exceeded JlUIJd� roa for human eonsumption and recreation. The intrinsic cytotoxicity of the samples was at a 1/8 dilution, but sorne samples were cytotoxic at dilutions of 1/128. Body flnids weremoíe'cytotoxic thanmeats, but a positive correlation between cytotoxicity and chemical contamination was not deterinined: apparently other pollutants not identified in this study were responsible. Fluid and meat capacity to inactivate 10 ID50% of poliovirus in cell culture was demonstrated. Samples that were toxic for cell cultures also showed a higher percentage of poliovirus inactivation. Monitoring chemical pollution in these waters is highly recoInmended. Key words: Bivalves, enterovirus, fecal coliforms, citotoxicity, poliovirus inactivation, chemical contamination. Las pianguas (Anadara tuberculosa, Bi­ valvia: Arcidae) constituyen uno de los princi­ pales moluscos bivalvos de importancia co­ mercial en Costa Rica (Campos et al. 1990). Sin embargo las aguas donde estos organismos se desarrollan presentan d�s peligros directos para el ser humano. El primero de ellos, es la contaminación fecal y el segundo, la contami­ nación química debido a la utilización desme­ dida de fertilizantes e insecticidas en las zOl}as agrícolas (Mutphy et al. 1979, McNeely 1979, Rao et al. 1 984, Anónimo 1993). Se ha demostrado que la descarga de las aguas negras en las costas es un riesgo para la salud pública, tanto para quiel}es se bañan, co­ mo para quienes' consumen bivalvos (pemánc dez ,etal. 1971, Wanke y Guerrant 1987). El consumo de estos moluscps ha causacio mu­ chos brotes de enfermedades entéric,as en va­ rios lugares del mundo (Dsenc1os 1991), debi­ cio a la capacidad que tienen de flltrar hasta 50 litros de agua por día (Martinez et al. 1991). Los virus de aguas negras cuando son ingeri­ dos por bivalvos son atrapados en la mu�osa de 420 REVISTA DE BIOLOGÍA TROPICAL las agallas y transportados por movimientos ci­ liares a la boca y luego al estómago. Aunque los virus de animales de sangre caliente no se replican en bivalvos, los virus pueden ser dige­ ridos por enzimas, transportados protegidos por macrófagos hacia la musculatura o ser eli­ minados por las heces (Campos 1990, MartÍ­ nez et al. 1991). De esta manera los bivalvos pueden actuar como concentradores tanto de bacterias como de virus, aumentando así las posibilidades de infección a la hora de consu­ mirlos cmdos o mal cocinados. La determinación de los coliformes feca­ les ha sido la prueba que se ha utilizado para evaluar el grado de contaminación fecal de las aguas y de los bivalvos que viven en ellas (Fer­ nández y Brunker ]977, McNeely 1979, Anó­ nimo 1993). Sin embargo, algunos autores han demostrado que los virus entéricos, por su re­ sistencia a pH ácido, sobreviven por tiempos más largos que los colifonnes fecales, hacien­ do importante la detección directa de estos agentes (Metcal[ 1978, Richards et al. 1982, Le Guyader et al. 1993, Gaswami et al. 1993). El método estándar para el aislamiento de virus de las aguas y de los bivalvos ha sido en cultivos celulares, el cual es lento, tedioso y caro. Sin embargo, se ha desarrollado la técni­ ca de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es mucho más rápida y muy sensi­ ble, pero con el inconveniente que no permite afirmar si el virus que se determina está en for­ ma viable o no (Atmar et al. 1993). Además de la presencia de microorganis­ mos, la contaminación química de las aguas se ha conveltido en un potencial riesgo para la sa­ lud. En los últimos años, en la costa del Pací­ fico en Costa Rica, la masa de agua del Golfo de Nicoya ha sido afectada drásticamente debi­ do al impacto de una contaminación progresi­ va, relacionada con el desarrollo poblacional tanto en sus márgenes como en el valle así co­ mo con el desanollo de las actividades agrope­ cuarias e industriales (Caba1ceta 1997). El objetivo de este trabajo es determinar la presencia de enterovirus (polio) y hepatitis A y contaminantes químicos en los líquidos y las car­ nes obtenidas a partir de bivalvos recolectados en el Estero de Puntarenas (Golfo de Nicoya) y en el manglar Sierpe- Térraba de Costa Rica. MATERIALES Y MÉTODOS Recolección de muestras: Las muestras fueron recolectadas durante la estación seca (de enero a abril) para evitar el efecto de dilu­ ción por lluvias. Durante ese año (1996) la precipitación lluviosa fue irregular, inclusive con inundaciones en febrero. Se recolectó una muestra por sitio, un total de 13 muestras: cuatro de ellas en el Golfo de Nicoya, más es­ pecíficamente en los manglares del Estero de Puntarenas (Chacarita, El Cocal, al frente del Club de Yates y al frente del mercado de Pun­ tarenas), cuatro muestras de diferentes sitios del manglar Sierpe- TélTaba en la Península de Osa y cinco muestras de diferentes pesca­ derías del área de San José. Cada muestra constó de 50 bivalvos, los cuales se guardaron en una bolsa estéril y se transportaron en frío al laboratorio. El mismo día de la recolec­ ción, cada bivalvo de cada muestra se lavó in­ dividualmente y se extrajo el molusco de la concha en forma aséptica. Una vez separados, cada muestra de 50 bivalvos se dividió en cin­ co partes para realizar las diferentes pruebas: tres partes para coliformes fecales y otras pruebas bacteriológicas que no se incluyen en este trabajo, una parte para la detección del virus de la hepatitis A (VHA) por PCR, y una parte para los estudios virológicos en cultivos celulares; esta última se guardó a -70°C has­ ta su procesamiento. Procesamiento de los líquidos: las mues­ tras se descongelaron en baño maría, penni­ tiendo la salida de los líquidos internos de los bivalvos al medio ambiente. Estos fueron reco­ lectados y centrifugados a 1200 g durante 15 min y luego a 10 000 g en una centrífuga refri­ gerada (lEC B-204). Una parte se filtró a tra­ vés de membranas de Millipore de O.22um y se guardó a -70°C y otra de 60 mI se precipitó con polietilen glicol (PEG-6000, Sigma) utilizando la técnica de Lewis y Metcalf ( 1988) para concentrar la muestra 20 veces. HERRERO et al.: Ausencia de enterovirus en Anadara tuberculosa Procesamiento de las carnes: una vez que se extrajo el líquido interno de los bival­ vos, se preparó una suspensión al 60% de las carnes en solución amortiguadora de fosfatos (PBS) complementada con 1000U/ug por ml de penicilina y estreptomicina (Sigma). Esta suspensión fue triturada en una licuadora y macerada en un mortero esféril: Las muestras fueron congeladas y descongeladas tres veces y fueron centrifugadas a 1200 g por 15 min y luego a 10 000 g por 30 mino Las muestras así procesadas se mantuvieron a -70°C hasta su posterior utilización. Número más probable: para la determi­ nación del Número más Probable de Colifor­ mes fecales (NMP CF) se utilizó el método de cinco tubos recomendado por la Asociación Americana de Salud Pública (Frampton y Res" taino 1993). Para la identificación de Escheri­ chía coZ¡ en los tubos lactosa y gas. positivo se utilizó agar Escherichia. coli con 50mglml de metilumbeliferil-B-D ácido glucurónjco (MUG). Se incubó a 45°C por 24 hr Y se reali­ zaron las lecturas (Scott et al 1987, Frampton y Restaino 1993). Reacción en cadena de la polimerasa: para la determinación del.ácido ribonucléico (ARN) del virus de la hepatitis A (VHA) se procedió a extraer 100 Jll de los líquidos de los bivalvos individuales con el sistema "Rneasy" (Qiagen Corp). Ocho microlitros del extracto de ARN fueron retrotranscritos con Super Script TI (GmCO BRL) con el "primer" anti­ sentido A3 de la región 5' no codificante. La amplificación se realizó con los "primers" Al y A3. Los productos se visualizaron por elec-' troforesis en gel de agarosa (Palacios 1998). Inoculación en monocapas celulares un día antes se prepararon tubos con monocapas de células Hep-2 (ATCC CCL 23) y FrhK-4 (ATCC CRL 1688) y se inocularon por duplicado con 0.2 ml de cada muestra de líquidos y carnes. Después de una hora de adsorción a 37°C, se agregó me­ dio de cultivo (MEM, Gibco) al 2% y se incu­ bó a 37°C. En el caso de las células Hep-2, se observó las monocapas diariamente al micros­ copio por diez días. Luego de ese período de para el aislamiento de virus: 421 tiempo, los tubos se congelaron y descongela­ ron tres veces, se centrifugó a 2 000 g por 15 min y el sobrenadante se guardó par�i hacer los pasajes ciegos. En el caso de las botellas con células FrhK-4 se incubó cuatro semanas a 37°C. Luego de ese período, las monocapas se congelaron y descongelaron tres veces, se eli­ minó los restos celulares por medio de-eentrifu-­ gación a 2 000 g durante 15 min y luego se de­ terminó la presencia del antígeno del virus de la hepatitis A por la técnica de radioinmunoensa­ yo (RIA) (Forghani 1979). Los sobrenadantes se emplearon para hacer los pasajes ciegos. Pruebas de citotoxicidad en cultivos ce­ a las suspensiones de los líquidos y las carnes se les realizó diluciones seriadas a partir de una dilución de 1/8 hasta 1/256 en medio MEM al 2% Y las diluciones se ensaya­ ron en monocapas de células Vero (ATCC CRL 6318) para detectar la toxicidad. Después de cinco días de observación, la máxima dilución donde se presentó toxicidad se tomó como la toxicidad intrínseca de la muestra. lulares: Capacidad de las muestras de inactivar se ,mezcló volúmenes iguales de cada muestra de los líquidos y de las carnes con 10 DI50% de poliovirus y se incu­ bó a 37°C durante una hora. Luego se inoculó en células Hep-2 y se incubó a 37°C. Se obser­ vó diariamente al microscopio por efecto cito­ pático (ECP) característico. Se consideró que las muestras donde no se presentó ECP tienen capacidad de inactivar o neutralizar el virus. Determinación de sUlfatos. y nitratos en la muestras: estas determinaciones se rea­ lizaron en el Centro de Investigación en Con­ taminación Ambiental (CICA) de la Universi­ dad de Costa Rica por el método de cromato­ grafía de iones de una sola columna con supre­ sión electrónica de conductividad' y detección conductimétrica (Anónimo 1991). el poliovirns tipo 1: . RESULTADOS En las pianguas recogidas del Manglar Sierpe-Térraba y en.tres de las cinco recogidas de las pescaderías se detectó menos de 2 NMP 422 REVISTA DE BIOLOGÍA TROPICAL CUADRO 1 Análisis bacteriológico de muestras de bivalvos-Costa Rica Lugar NMP CF*/loo mI Agua** Sierpe 1 Sierpe 2 Sierpe 3 Sierpe 4 Pescadería 1 Pescadería 2 Pescadería 3 Pescadería 4 Pescadería 5 Chacarita**** Club de Yates**** Cocal Estero Adentro**** Frente Mercado**** * ** *** NSH **** = = = 7 4 11 17 NSH NSH NSH NSH NSH 33 NMP CF*/g Pianguas*** <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 > 16000 3500 23 460 4 350 4 350 <2 Coliformes fecales. E. coZ¡ o bacterias coliformes termotolerantes no deben ser detectadas en una muestra de 100 mI de agua. (APHA, 1991). Normales para bivalvos. (menor que 230CF por 100 mI) (APHA, 1991) No se hizo. Sitios de muestreo en el Estero de Puntarenas. CF/g (Cuadro 1). Sin embargo, en dos de las muestras de pescadería se obtuvo conteos más altes de lo permitido para consumo humano. En el agua recogida del manglar del río Sierpe, se determinó contaminación por coliformes fe­ cales aunque los conteos fueron mucho meno­ res que los que se detectaron en las aguas del estero de Puntarenas. No se determinó corre­ lación entre el contenido bacteriano de las aguas y los bivalvos en ninguna de las mues­ tras analizadas. No se logró el aislamiento de ningún agente citopatogénico en las células Hep-2 después de realizar cinco pasajes ciegos. Es importante aclarar que ni en los análisis direc­ tos ni en las muestras concentradas se logró de­ terminar la presencia de enterovirus en los lí­ quidos y en las carnes de los bivalvos. Tampo­ co fue posible el aislamiento del virus de la Hepatitis A de los líquidos o las carnes, des­ pués de tres pasajes ciegos en las células FrhK4 a pesar que se detectó genomas virales por la reacción de la polimerasa en los líquidos pero no en las carnes de las muestras de Chacarita, Club de Yates y Cocal del Estero de Puntarenas (Cuadros 2 y 3). El estudio de la contaminación química se realizó mediante pruebas de toxicidad de los líquidos y las carnes de los bivalvos en cultivos celulares. En el cuadro 2 se observa la toxicidad de los líquidos de los bivalvos en los diferentes sitios de muestreo. Los líqui­ dos de los bivalvos de las pescaderías mostra­ ron una toxicidad relativamente baja « 118 y 118), por el contrario las muestras obtenidas de sitios del Manglar Sierpe- Térraba y de Puntarenas presentan toxicidad a diluciones de 1132 a 11 128. En el Cuadro 3 se muestra la toxicidad de las carnes, las cuales en gene­ ral son mucho menos tóxicas que los líquidos respectivamente, con excepción de las carnes de los bivalvos de las pescaderías, que mos­ traron una toxicidad mayor con respecto a los líquidos. Para tratar de establecer el tipo de tóxicos presentes en las muestras, se determinó nitra­ tos y sulfatos en los líquidos y las carnes de los bivalvos. Como se observa en los cuadros 2 y 3, la concentración de nitratos en todas las muestras fue mucho mayor a lo aceptable para consumo humano y en el caso de los sulfatos todas excepto dos muestras se encontraron por arriba del límite normal. Se determinó si la citoxicidad de los líqui­ dos y las carnes de los bivalvos podrían tener algún efecto sobre la replicación de un virus. Para ello se realizó una prueba de inactivación o neutralización utilizando el poliovirus tipo 1 en células Yero. Como se puede observar en los Cuadros 2 y 3, los líquidos tuvieron más capacidad de inactivar la cepa de referencia de poliovirus 1 que las carnes y se demostró una correlación entre citotoxicidad e inactiva­ ción en la mayoría de los casos. DISCUSIÓN Los coliformes han sido utilizados como indicadores sanitarios de la calidad del agua y HERRERO et al.: Ausencia de enterovirus en Anadara tuberculosa 423 Cuadro 2 Análisis en cultivos celulares y estudio químico de los líquidos corporales Toxicidad en Células (Título) Sierpe 1 Sierpe 2 Sierpe 3 Sierpe 4 Pescadería 1 Pescadería 2 Pescadería 3 Pescadería 4 Pescadería 5 Chacarita**"" Club de Yates"**" Cocal Estero Adentro"*** Frente Mercado"*** % InaclÍvación NSH Nitratos Sulfatos **** Cloruros PCR VHA + lnactivación (%) del Virus de la Polio 0% 1/32 1/32 1I32 l/32 1/8 <1/8 <l/8 <1/8 1/8 1/128 1/128 1/128 1/128 75% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 50% 100% 50% 75% 50% Concentración Nitratos Sulfatos (mgJL) (mglL) 1.800 NSH NSH 2.000 600 360 NSH NSH NSH 1.400 NSH 2.000 NSH 1.520 NSH NSH 2.700 800 400 NSH NSH NSH 1.300 NSH 1.700 NSH PCR VHA + + + Inactivación del virus por la muestra. Se realizó con la mínima dilución en que no produce citotoxi­ cidad en cultivos celulares. No se hizo. 10 mglL, es lo aceptable para agua de consumo humano. 150 - 500 mgJL, es lo aceptable para agua de consumo humano. Sitios de muestreo en el Estero de Puntarenas. Depende de la salinidad del agua. Reacción en cadena de la polimerasa. Virus de la hepatitis A. No se detectaron genomas virales. Si se detectaron genomas virales Cuadro 3 Análisis en cultivos celulares y estudio químico de las carnes de Toxicidad en Células (Título) Sierpe 1 Sierpe 2 Sierpe 3 Sierpe 4 Pescadería 1 Pescadería 2 Pescadería 3 Pescadería 4 Pescadería 5 Chacarita**�* Club de Yates'""*" Cocal Estero Adentro**** Frente Mercado***" % Inactivación NSH Nitratos Snlfatos **** Cloruros PCR VHA + 1/32 1/32 1/32 1/8 l/S 1/32 l/8 l/8 1/8 1/32 1/32 1/8 1/32 Inactivación (%) del Virus de la Polio 0% 0% 0% 0% 0% 0% Qqb 0% 0% 25% 50% 0% 0% Anadara tuberculosa Concentración Nitratos Sulfatos (mglL) (mglL) 1.100 NSH NSH 1.400 1.500 980 NSH NSH NSH 1.600 NSH 90 NSH PCR VHA 580 NSH NSH 940 720 620 NSH NSH NSH 1.300 NSH 62 NSH Inactivación del virus por la muestra. Se realizó con la mínima dilución en que no produce citotoxi­ cidad en cultivos celulares. No se hizo. 10 mglL, es lo aceptable para agua de consumo humano. 150 - 500 mg/L, es lo aceptable para agua de consumo humano. Sitios de muestreo en el Estero de Puntarenas. Depende de la salinidad del agua. Reacción en cadena de la polimerasa. Virus de la hepatitis A. No se detectaron genomas virales. Si se detectaron genomas virales 424 REVISTA DE BIOLOGÍA TROPICAL también para clasificar las áreas para recolec­ ción de bivalvos (Larkin y Hunt 1982, Chai et al. 1994, Danies et al. 1995), sin embargo, al­ gunos autores (Sobsey el al. 1978, Goyal et al. 1979, Metcalf et al. 1980, Anónimo 199 1) han demostrado que los coliformes no son indica­ dores inequívocos. Los resultados obtenidos en este trabajo coinciden con la ausencia de corre­ lación entre el contenido bacteriano de las aguas y los bivalvos. En 1984, Araya y Rodríguez determinaron que el agua del Estero de Puntarenas era ina­ ceptable para consumo y para la recreación, mostrando valores en el número más probable de coliformes totales entre 64 y 24 000/ 100m1 y los bivalvos mostraron valores que fluctura­ ron entre 15 000 Y 900 000/100 g. Otro estu­ dio realizado entre 1985 a 1987 (Villalobos y Fernández 1988), demostraron que la contami­ nación en tres sitios del Golfo de Nicoya era muy alta; por lo tanto, los moluscos que ahí ha­ bitaban eran inaceptables para el consumo hu­ mano. Aunque este tipo de estudios no pueden ser comparados, ya que los conteos fluctúan de mes a mes (Villalobos y Fernández 1988), la diferencia en los valores de los coliformes ob­ tenidos en los estudios de los años ochenta y este trabajo es muy marcada. Varios estudios han demostrado que la po­ sibilidad de aislamientos de virus entéricos de bivalvos es baja, con una variación del 34 al 50% (Sobsey et al. 1978, Lewis y Metcalf 1988). Este hecho puede ser explicado por va­ rias razones, como por ejemplo la calidad del agua y la presencia de compuestos orgánicos que pueden inhibir las partículas virales, los compuestos cÍtotóxicos capaces de interferir con la adsorción de los virns a las células, la preparación de las muestras o los mismos teji­ dos de los bivalvos (Sobsey et al. 1978, Met­ calf et al. 1980). Aún así, la ausencia de aisla­ mientos virales de las muestras de los bivalvos es difícil de explicar ya que alrededor de cier­ tos sitios de recolección (especialmente Punta­ renas), existen asentamientos humanos que no cuentan con lugares adecuados para la elimina­ ción de excretas, por lo tanto, se esperaba una contaminación fecal más alta con la consecuen- te posibilidad de aislamientos de virus, ya que los enterovims son habitantes normales del tracto intestinal del ser humano y se excretan por las heces frecuentemente (Me1nick 1995). Con el fin de establecer el papel de otros factores que pudieran interferir en el aisla­ miento de agentes virales, se realizó la prueba de toxicidad de los líquidos y las carnes de los bivalvos en cultivos celulares, que es un buen indicador de contaminación química. Los lí­ quidos de los bivalvos de las pescaderías mos­ traron una toxicidad relativamente baja con respecto a las muestras obtenidas de sitios del manglar Sierpe - Térraba y de Puntarenas. La toxicidad de las carnes, en general, fue menor que los líquidos, con excepción de las carnes de los bivalvos de las pescaderías, que mostra­ ron una toxicidad mayor con respecto a los lí­ quidos. Esto último podría deberse a la mani­ pulación propia de los bivalvos en las pescade­ rías. Los resultados indican que la toxicidad mínima de las carnes de estos moluscos se ob­ tiene a una dilución de l/8, posiblemente por constituyentes intrínsecos de los tejidos (Vaughn et al. 1979). Sin embargo, la toxici­ dad detectada a una dilución de 1/128 es muy significativa, pudiendo indicar factores que in­ terfieren con el aislamiento viral en cultivos celulares. Para tratar de establecer el posible tipo de tóxicos presentes en las muestras, se determi­ naron nitratos y sulfatos en los líquidos y las carnes de los bivalvos. La presencia de nitra­ tos en agua en concentraciones mayores a 5 mg/L pueden reflejar condiciones insolubles de las muestras, ya que una de las mayores fuentes de nitratos son los desechos de huma­ nos y animales. Como se observó en los resul­ tados, las concentraciones de nitratos en todas las muestras fue mucho mayor a lo aceptable para consumo humano, indicando contamina­ ción fecal o la presencia de fertilizantes en las aguas. El sitio de toma de muestra en Chacari­ ta concuerda con el asentamiento humano an­ tes mencionado además de una Planta Indus­ trial de Fertilizantes, por lo tanto, esas aguas podrían estar contaminadas tanto con materia fecal como química. Como se demostró en HERRERO etal.: Ausencia deenterovirus en Anadara tuberculosa AGRADECIMIENTOS resultados (Cuadro l),los conteos de colifor­ mes en ese sitio son bajos con respecto a los otros sitios del Estero de Puntarenas y también mostró concentraciones altas de nitratos y sul­ fatos. Ruiz y Mora en 1993 revelaron que el 425 gracias a los la Vicen-ectoría de Inves­ Este proyecto se llevó a cabo fondos recibidos por tigacióÍl de la Universidad de Costa Rica Sin embargo, en'este tra­ (#430·96·212 y #430-96·214), al Convenio 9451 BID·CON1CIT (388RC) y al Centro Na­ Cional de Ref�rencia para Cólera-INCIENSA al facilitar las muestras de piangua yagua, así toxicidad de las muestras en cultivo celular y la coliformes fecales incluidas en el estudio. uso que se le da alEsterb dePuntarenas es muy variado, siendo lo más común la descarga de désechbs domésticos·e industriales, especial·­ mente agroquímicos. bajano se encontró unacorrelación el1tre la presencia de nitratos en el agua, lo que sngiere existencia de otros contaminantes. Se trató de determinar si los diferentes re­ sultados de toxicidad en cultivos celulares' po­ drían tener algúri efecto sobre la replicación de la un virus, Para ello se realizó una prueba, de imtctíva¡::ión o neutralización utilizando el virus de la polio. Los líquidos tuvieron más ca­ pacidad deinactivar la cepa de referencia de poliovinis í que las carnes y las muestras con títrilos más elevadas de citotoxicidad presenta­ ,ron asu vez mayor capacidad de j�lactiva.r el virus en cultivos celularés. Estos resultados su­ giyren que deben existir otros cOlltaininanies quími cos en las llguas y/oen 10sbivalvQs c¡tpa­ ,,'ces de lnactivar el virus. Eh Europa se ha descubierto lluanueva contamil}¡tción de 110s, lagos ymaresporprQ­ duetos farmacéuticos como antibióticos, ana!;­ gésicos, antiséptkós ' y drogas para disminuir elcolesterol(RaI()f 1998). Las, drogas conta­ n1Ínan las aguas al ser lib\Oradas �n los dese­ chos humanos. Actualmente no se, conoce cual es la toxicidad potencial de estos agentes púa eÍ' ser humano, los animales y los, siste­ mas, acuáticos, pero ,se cree que las drogas parcialmente degradadas podrían volver a su forma activa por medio de reacciones quími­ casen ,el ambiente. Como se ha expuesto anteriormente, el aisláriliento de vims de los bivalvos nó es efic citynte por los. métodos conocidos, pero snr'l1a" do alosbajosconteos de coliformes fecales en , aguas potencialrllente contamiIüidas ylaalta contaminaCión quimicade éstas, hacehn p cra­ tivo continuar con la vigilancia de la contamic nación química ambiental. como l a información sobre contaminación de Además agradecernos al Centro de Investiga­ ción en Contaminación Ambiental las determinaciones (CICA), por de nitratos y sulfatos y por aportes en el manuscrito_ Ta.mbién agrade­ de Vi­ rología de la Facultad de Microbiología por su ayuda técnica. sus cernos a Edwin Carrem del Laboratorio RESUMEN Anadara tubúculosa es uno de Jos moluscos inás abun.dantes de importancia comercial eIl Costa Rica. Su J:¡ábitat acuático es uua fllente pote11ci'!J de contaminación fec�ly química p¡rra el serhmnano. ,El objetivo de este trabajo fue determinar e�lterovírus, especialmente poliovi­ , rusy el virus de la bepatitis A y contaminación química co" monitratos y sulfatosenlas carues y los líquidos internos. . Serecogieron trece nwestr�s <le cuatro sitios del' golfó.de NiCoya, de tres siti� s del ,maIlgI¡rr Sierpe-TéLTab� (Pacífico de Costa Rica) y de GÍm;o pescaderías de S�n José, la ca­ 1) pital de Costa Rica. Las, muestras fueron ensayadas por colifol'mes fecales (Número Más Probable/lOO rtll), 2) ais­ lamiento de enterovirus en cultiv os celulares (Hep-2 y FrhK-4), ,,3) citotoxiCidaden céhJlas Veroy 4)I,ahabilidad de las muestras de inac¡ivar 10 PI50% de poliovirus en cultivos celulares. El Número Más Probable/lOO mi de las aguas fuemás altq de lo queseconsipera adecuado para el uso recreacíonal, aunque los coliformes en lo� liquidos y las carn�s [ueen generalmllcho más bajo. No se logr6 el aislamiento de ningún agente citopatogénico, petoencon� tramos que la concentraCión de nitratos y, sulfatos de las muestras fue mayor alo aceptabl�paracqnsumo hÚlJla�0. La toxicidad intrínseca de las muestras en cultivos celula­ res fuede un¡¡cí.ilucióu de 118 aunque algunas n\uestras mostrai'on toxicidad a una clilllción de [/128. Los líquidos fueron más tó¡¡k.os que las carn",s pero 110 se eIlc9p1ró una correlación cntrela toxicidad en cul ti v o s ;e elulares y la to­ xicidad quílilic !1: aparentemente otros contaminantes 110 . identificados e;l este trabajo fueron l os responsables. Se analizó la habilidad de los líquidos y las carnes de inacti­ varIO D150% depoliovÍru s demostrando, que los líquidos y las carnes con más toxicidad en cultivos celulares fueron REVISTA DE BIOLOGÍA TROPICAL 426 los que mostraron un porcentaje mayor de inactivación del poliovirus. Se recomienda la vigilancia de la contamina­ ción química de estas aguas. REFERENCIAS Anónimo. 1991. 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