Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 Artı́culo original Influencia de los polimorfismos de CYP2C19 en la reactividad plaquetaria y el pronóstico en una población no seleccionada de pacientes con sı́ndrome coronario agudo sin elevación del ST Antonio Tello-Montoliua, Eva Jovera, Francisco Marı́na,b, Agustina Bernalb,c, Marı́a L. Lozanob,c, Beatriz Sánchez-Vegab,c, Francisco J. Pastora,b, José A. Hurtadoa,b, Mariano Valdésa,b, Vicente Vicenteb,c y José Riverab,c,* a b c Servicio de Cardiologı´a, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, El Palmar, Murcia, España Universidad de Murcia, Murcia, España Centro Regional de Hemodonación, Murcia, España Historia del artı´culo: Recibido el 23 de febrero de 2011 Aceptado el 12 de julio de 2011 On-line el 23 de noviembre de 2011 Palabras clave: Angina inestable Inhibidores de la agregación plaquetaria Plaquetas CYP2C19 RESUMEN Introducción y objetivos: Los alelos CYP2C19*2 y *17 parecen relacionarse con la variabilidad en el metabolismo del clopidogrel. Los objetivos del presente estudio son valorar la relación fenotipo-genotipo asociada a los polimorfismos CYP2C19*2 y *17 y explorar el impacto clı́nico de estos polimorfismos durante 6 meses de seguimiento en una población no seleccionada con sı́ndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST. Métodos: Se reclutó a 40 pacientes estables doblemente antiagregados, 12 meses después del implante de stent coronario para el primer objetivo, y a 493 pacientes ingresados con sı́ndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST para el segundo. La reactividad plaquetaria se evaluó mediante agregometrı́a óptica estimulando las plaquetas con adenosina difosfato o péptido activador del receptor de trombina, y valorando la fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores fosforilada mediante citometrı́a de flujo. El genotipo para los polimorfismos CYP2C19*2 y *17 se analizó con sondas TaqMan. Resultados: Sólo el test de fosforilación de fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores mostró diferencias significativas en la reactividad plaquetaria entre los pacientes portadores y no portadores de los alelos CYP2C19*2 (p = 0,020) y *17 (p = 0,048). No se observó asociación con el pronóstico a 6 meses de los alelos CYP2C19*2 ([HR (IC95%): 1 (0,94-1,55)], p = 0,984) y *17 ([HR (IC95%): 0,93 (0,61-1,43)], p = 0,753). Conclusiones: Los polimorfismos de CYP2C19 *2 y *17 se relacionaron con la reactividad plaquetaria, pero no con el pronóstico a 6 meses, en el que multitud de variables deben influir. ß 2011 Sociedad Española de Cardiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. Influence of CYP2C19 Polymorphisms in Platelet Reactivity and Prognosis in an Unselected Population of Non ST Elevation Acute Coronary Syndrome ABSTRACT Keywords: Unstable angina Platelet aggregation inhibitors Platelets CYP2C19 Introduction and objectives: CYP2C19*2 and CYP2C19*17 alleles appear to contribute to heterogeneous clopidogrel metabolism. The aims of the present study were to assess the phenotype-genotype relationship of CYP2C19*2 and *17 allele carriage and to explore the clinical impact of those polymorphisms at 6-month follow-up of an acute event in an unselected population of non-ST elevation acute coronary syndrome. Methods: Recruitment for the first and second objectives was 40 stable acute coronary syndrome patients under dual antiplatelet therapy at 12 months after coronary stent placement and an unselected population of 493 consecutive patients with non-ST elevation acute coronary syndrome, respectively. Platelet reactivity was assessed by optical aggregometry induced by adenosine diphosphate and thrombin receptor activating peptide, and by vasodilator-stimulated phosphoprotein phosphorylation measurement using flow cytometry. Genotypes were determined with a TaqMan assay. Results: Only the vasodilator-stimulated phosphoprotein phosphorylation measurement detected significant differences in on-clopidogrel platelet reactivity between the wild-type subjects and the CYP2C19*2 (P=.020) and *17 allele carriers (P=.048). No significant difference was found between CYP2C19*2 ([HR (95%CI): 1 (0.94-1.55)], P=.984) or *17 ([HR (95%CI): 0.93 (0.61-1.43)], P=.753) allele carriage and the occurrence of adverse events at 6-month follow-up. VÉASE CONTENIDO RELACIONADO: DOI: 10.1016/j.recesp.2011.09.024, Rev Esp Cardiol. 2012;65:205–7. * Autor para correspondencia: Centro Regional de Hemodonación, Ronda de Garay s/n, 30003 Murcia, España. Correo electrónico: jose.rivera@carm.es (J. Rivera). 0300-8932/$ – see front matter ß 2011 Sociedad Española de Cardiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. doi:10.1016/j.recesp.2011.07.013 220 A. Tello-Montoliu et al / Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 Conclusions: Even though CYP2C19 genotype is associated with variable on-clopidogrel platelet reactivity, it has no significant clinical influence. Prognosis of acute coronary syndromes may be influenced by a myriad of variables. Full English text available from: www.revespcardiol.org ß 2011 Sociedad Española de Cardiologı́a. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved. Abreviaturas CYP: citocromo P450 ICP: intervención coronaria percutánea IFM: intensidad de fluorescencia media PRI-VASP: ı́ndice de reactividad plaquetaria-fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores SCASEST: sı́ndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST TRAP: péptido activador del receptor de trombina INTRODUCCIÓN El clopidogrel es un profármaco que debe ser biotransformado para inhibir irreversiblemente al receptor de adenosina difosfato (ADP) P2Y12. La biotransformación del clopidogrel a su derivado tiol activo requiere dos pasos oxidativos en los que intervienen isoenzimas del citocromo P450 (CYP) hepático, como CYP2C19, 3A4/5, 1A2, 2B6 y 2C91. Algunos estudios indican que los polimorfismos del CYP pueden ser causa, al menos en parte, de la heterogeneidad de la respuesta al clopidogrel2. Recientemente, se ha analizado la contribución in vitro de cada CYP, y se ha demostrado1 que el metabolismo del clopidogrel depende principalmente del CYP2C19. Ası́, los alelos de pérdida de función del CYP2C19, como el alelo *2, se asocian a un deterioro de la conversión del clopidogrel en su metabolito activo, una mayor reactividad plaquetaria durante el tratamiento con clopidogrel y una mala evolución clı́nica, en especial por el aumento del riesgo de trombosis del stent3–5. En cambio, el alelo CYP2C19*17 se asocia a una potenciación de la respuesta plaquetaria al clopidogrel6, y los portadores de esta variante polimórfica podrı́an obtener mayor beneficio que los no portadores con tal tratamiento7. Sin embargo, no está clara todavı́a la trascendencia clı́nica de los alelos CYP2C19*2 y *17; los análisis recientes de otras series de pacientes han mostrado resultados contradictorios en cuanto a la relación entre la eficacia del clopidogrel y el estado de portador de los alelos3–7. Los objetivos de nuestro estudio son evaluar la relación fenotipo-genotipo asociada a los polimorfismos CYP2C19*2 y *17 en 40 pacientes estables doblemente antiagregados mediante el empleo de diferentes métodos de valoración de la función plaquetaria y explorar la influencia pronóstica de estos polimorfismos en una cohorte no seleccionada de 493 pacientes con sı́ndrome coronario agudo sin elevación del ST (SCASEST) a los 6 meses de seguimiento. MÉTODOS Pacientes Para el primer objetivo, incluimos a 40 pacientes caucásicos estables en tratamiento de antiagregación doble con ácido acetilsalicı́lico y clopidogrel. A todos ellos se les realizó intervención percutánea coronaria (ICP) e implante de stent, por recurrencia de eventos, en los 12 meses previos a la inclusión en el estudio. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: edad > 18 años, ausencia de trastornos hemorrágicos o contraindicaciones para el tratamiento doble antiagregante y ausencia de eventos isquémicos que hubieran requerido hospitalización durante al menos los 6 meses previos a la inclusión en el estudio. Se obtuvieron las caracterı́sticas clı́nicas y demográficas, ası́ como información detallada de la ICP a partir de las historias clı́nicas. Se implantaron stents metálicos convencionales o liberadores de fármacos, siguiendo las recomendaciones actuales, según el criterio del cardiólogo intervencionista. Después de la intervención, se continuó con la administración de dosis de mantenimiento de ácido acetilsalicı́lico a razón de 100 mg/dı́a y clopidogrel a razón de 75 mg/dı́a, según los protocolos actuales8. Para el segundo objetivo, reclutamos a 493 pacientes caucásicos consecutivos diagnosticados de SCASEST admitidos en tres hospitales terciarios españoles. Se excluyó a 65 pacientes a causa de una interrupción temprana del tratamiento con clopidogrel. Por ello, finalmente se dio seguimiento durante 6 meses a 428 pacientes. Incluimos a pacientes que acudieron al servicio de urgencias y cumplı́an al menos dos de los siguientes criterios: a) dolor torácico tı́pico; b) alteraciones electrocardiográficas que indicaran isquemia, como la depresión del segmento ST  0,5 mm en al menos dos derivaciones consecutivas o la inversión de la onda T  0,2 mV, y c) elevación de los valores de troponina T por encima del punto de corte ( 0,1 ng/ml). Se excluyó a los pacientes con enfermedades infecciosas/inflamatorias concomitantes, discrasias hematológicas o contraindicaciones para el tratamiento antiagregante. Todos los pacientes recibieron un tratamiento estándar según lo recomendado en las guı́as actuales para el SCA8, doble terapia antiagregante, inhibidores de la glucoproteı́na IIb/IIIa, ası́ como bloqueadores beta, inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina, heparina de bajo peso molecular y estatinas cuando era apropiado. Además, se calculó la puntuación de riesgo TIMI para el SCASEST en todos los pacientes9. Posteriormente se realizó una angiografı́a coronaria y/o una ICP, a criterio del cardiólogo responsable. El seguimiento a 6 meses se realizó mediante visitas ambulatorias, contactos telefónicos y revisión de las historias clı́nicas. Identificamos como «eventos adversos»: muerte cardiovascular o sı́ndrome coronario agudo recurrente que requiriera ingreso hospitalario. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por el comité ético local. Procedimientos de laboratorio Para el primer objetivo, se extrajeron muestras de sangre a las ocho de la mañana en la clı́nica ambulatoria, tras una noche en ayunas, sin haber fumado ni consumido bebidas con alcohol o cafeı́na. En el momento de obtención de las muestras, todos los pacientes recibı́an diariamente doble terapia antiagregante (100 mg de ácido acetilsalicı́lico y 75 mg de clopidogrel). Las muestras de sangre se obtuvieron mediante punción venosa, en tubos con citrato trisódico al 3,2% para las pruebas de reactividad plaquetaria o en tubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para la obtención de ADN genómico. Se obtuvo plasma rico en A. Tello-Montoliu et al / Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 plaquetas para los tests de agregación, a partir de sangre citrada, mediante centrifugación a 150/g durante 10 min a temperatura ambiente, y se utilizó sin un ajuste para el recuento de plaquetas, en un plazo de 3 h tras la obtención de la muestra de sangre. Para el segundo objetivo, se obtuvieron muestras de sangre venosa en las primeras 48 h tras el ingreso del paciente, siempre antes de la angiografı́a coronaria, utilizando suero y tubos con EDTA. Para los tests de ADN genómico (ambos objetivos), se utilizaron tubos con EDTA que se centrifugaron a 1.500/g durante 12 min a temperatura ambiente; se recogieron los estratos de leucocitos que se conservaron a –80 8C hasta realizar el análisis por lotes. Las concentraciones de troponina T de los pacientes con SCASEST se determinaron en muestras séricas al ingreso y a las 6 y 12 h posteriores, utilizando un enzimoinmunoanálisis de un solo paso, con tecnologı́a de electroquimioluminiscencia (Elecsys, Roche Diagnostics, Basilea, Suiza). Pruebas de función plaquetaria Pruebas de agregación plaquetaria La agregometrı́a de transmisión óptica se realizó en un agregómetro estándar (Aggrecorder II, Menarini Diagnostics, Florencia, Italia) a 37 8C y 1.000 rpm. Se monitorizaron los cambios de la transmisión óptica durante 5 min en plasma rico en plaquetas no ajustado para el recuento de plaquetas10 tras la estimulación con: ADP a concentraciones de 5 mM y 10 mM (DiaMed, Cressier, Suiza) y péptido activador del receptor de trombina (TRAP) a 25 mM (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, Missouri, Estados Unidos). El criterio de valoración de la reactividad plaquetaria corresponde al máximo porcentaje de luz transmitida, tomando el plasma autólogo pobre en plaquetas como la referencia del 100%. La agregación inducida por TRAP se empleó como control intraanalı́tico positivo en cada paciente, ya que la respuesta plaquetaria al péptido está mediada por el receptor de trombina receptor 1 activador de proteasa, y las tienopiridinas no la bloquean. I´ndice de reactividad plaquetaria-fosfoproteı´na estimulada por vasodilatadores La determinación de los valores de fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores (VASP) fosforilada es un indicador de la reactividad de P2Y12 y, por lo tanto, de la inhibición inducida por clopidogrel11. Los valores de VASP fosforilada se cuantificaron mediante la determinación del ı́ndice de reactividad plaquetaria (PRI) mediante citometrı́a de flujo (Beckman Coulter FC500, Miami, Florida, Estados Unidos) utilizando anticuerpos monoclonales marcados y siguiendo las instrucciones del proveedor (Platelet VASP, Diagnostica Stago, Biocytex Inc., Marsella, Francia). La población de plaquetas se identificó por las distribuciones de dispersión frontal y lateral hasta objetivar 5.000 eventos. El grado de fosforilación de VASP se determinó mediante la diferencia en los valores de la media geométrica de la intensidad de fluorescencia media (IFM) en muestras incubadas con PGE1 en presencia o en ausencia de ADP (IFMPGE1+ADP e IFMPGE1, respectivamente). Después de sustraer los valores de control isotı́picos negativos de los valores de fluorescencia correspondientes, se calculó el PRI(%) con la siguiente fórmula: PRI(%) = [(IFMPGE1) – (IFMPGE1+ADP) / (IFMPGE1)]  100. El cociente se expresó como reactividad plaquetaria porcentual media y es inversamente proporcional a la inhibición plaquetaria producida por clopidogrel. 221 Determinación del genotipo Se purificó el ADN genómico usando el Puragene Blood Core Kit B (QIAGEN Sciences, Germantown, Maryland, Estados Unidos). El análisis genotı́pico de los polimorfismos CYP2C19*2 (681G>A; rs4244285) y CYP2C19*17 (–806C>T; rs12248560) se realizó con TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Carlsbad, California, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando LC480 Real Time PCR (Roche, Basilea, Suiza). Se analizaron los genotipos sin conocer los valores de agregación plaquetaria ni la evolución clı́nica de los pacientes. Con objeto de asegurar un manejo correcto de las muestras, se repitió la genotipificación en el 20% de los pacientes, y se obtuvieron idénticos resultados. Se efectuó la determinación genotı́pica de las dos variantes alélicas en todos los pacientes incluidos en el estudio; por consiguiente, la tasa de determinación inequı́voca (call rate) fue del 100%. Análisis estadı́stico Las variables se presentan en forma de media  desviación estándar, recuentos (porcentajes) o mediana [intervalo intercuartı́lico]. Se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para verificar la distribución normal de los datos de las variables continuas. Las variables discretas se compararon utilizando la prueba de la x2. Las de variables continuas se compararon con la prueba de la t de Student para datos no apareados bilateral o con la prueba de la U de MannWhitney según la distribución de los datos. Los cálculos para las variables de valoración de interés se basaron en la comparación del estado de portador de los alelos CYP2C19*2 y CYP2C19*17 en los individuos de tipo silvestre (G/G o C/C, respectivamente) y los portadores del alelo polimórfico (combinación de G/A y A/A, ası́ como C/T y T/T, respectivamente). Se eligió un modelo dominante en ambos casos, ya que los alelos polimórficos */A o */T producen pérdida o ganancia completa de la función enzimática, lo cual significa que un alelo polimórfico ejerce un efecto relevante en la actividad enzimática total. La desviación respecto al equilibrio de Hardy-Weinberg se evaluó en ambas poblaciones con la prueba de la x2 para cada polimorfismo. Se analizó la proporción de riesgo relativo mediante regresión de Cox univariable sin ajustar, para comparar los eventos registrados durante el periodo de seguimiento entre los sujetos portadores de los alelos polimórficos y silvestres, tomando a los segundos como grupo de referencia en cada caso. Se calcularon las tasas de supervivencia totales con el método de Kaplan-Meier, y se determinaron las diferencias con log rank. Se aceptaron como estadı́sticamente significativos todos los valores de p < 0,05. El análisis estadı́stico se realizó con el programa SPSS 17.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, Estados Unidos). RESULTADOS Relación entre el genotipo CYP2C19 y la reactividad plaquetaria durante el tratamiento Las caracterı́sticas clı́nicas basales de los 40 pacientes en los que se evaluó la reactividad plaquetaria durante el tratamiento se presentan en la tabla 1. De forma resumida, la media de edad de esa población era 65,8  10 años; 36 (90%) eran varones. A todos los pacientes se les habı́a implantado al menos un stent; a 32 (80%) de ellos se les implantó stents liberadores de fármacos y a 8 (20%), stents convencionales. La distribución de genotipos fue la siguiente: el 77,5% GG, el 17,5% GA y el 5% AA para el polimorfismo CYP2C19*2, y el 67,5% CC, el 30% CT y el 2,5% TT para el polimorfismo CYP2C19*17. Para las distribuciones del genotipo CYP2C19*17, no se observó ninguna 222 A. Tello-Montoliu et al / Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 Tabla 1 Caracterı́sticas basales de 40 pacientes con sı́ndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST incluidos en el estudio del primer objetivo Variable Alelo CYP2C19*2 Alelo CYP2C19*17 Total G/G */A C/C */T Pacientes, n (%) 31 (77,5) 9 (22,5) 27 (67,5) 13 (32,5) 40 (100) Edad (años) 65,9  8,9 65,6  13,7 66,5  10,7 64,1  8,6 65,8  10 Edad  65 años (%) 54,8 66,7 63 46,2 57,5 Varones (%) 93,5 77,8 85,2 100 90 Hipertensión (%) 78,6 66,7 68 91,7 75,7 Dislipemia (%) 64,3 44,4 52 75 59,5 Diabetes mellitus (%) 50 33,3 44 50 45,9 Tabaquismo (%) 25 0 16 25 18,9 SMC (%) 22,6 11,1 22,2 15,4 20 SLF (%) 77,4 88,9 77,8 84,6 80 SLF: stent recubierto de fármaco; SMC: stent metálico convencional. La edad se expresa en media  desviación estándar. Tabla 2 Efecto del genotipo CYP2C19 en la agregación plaquetaria máxima inducida por adenosina difosfato durante el tratamiento con clopidogrel en pacientes con una intervención coronaria percutánea e implantación de stent Polimorfismo N Agregación plaquetaria ADP 5 mM Agregación plaquetaria ADP 10 mM CYP2C19*2 G/G */A p 31 9 47,1  14,3 54,2  12,5 0,190 54,2  15,5 62,6  17,4 0,170 CYP2C19*17 C/C */T p 27 13 50,3  14,6 45,5  12,8 0,319 58,1  16,4 51,9  15,4 0,265 ADP: adenosina difosfato. Los resultados se presentan como valores medios del porcentaje máximo de agregación, media  desviación estándar. A 100 p = 0,020 PRI-VASP (%) 80 60 40 20 0 GA + AA GG G/G frente a */A B 100 p = 0,048 80 PRI-VASP (%) desviación significativa del equilibrio de Hardy-Weinberg (p = 0,698), no ası́ para el CYP2C19*2 (p = 0,009). La reactividad plaquetaria residual observada en los pacientes según los polimorfismos CYP2C19*2 y CYP2C19*17 se resume en la tabla 2. Tal como puede apreciarse, no hubo diferencias significativas entre los individuos silvestres y los polimórficos en cuanto a la reactividad plaquetaria residual inducida por ADP 5 y 10 mM, medida con agregometrı́a óptica. La agregación inducida por TRAP medida con agregometrı́a óptica estuvo en la franja de normalidad descrita para sujetos sanos tanto en los pacientes de tipo silvestre como en los polimórficos (datos no presentados). Por otro lado, los portadores del alelo CYP2C19*2 */A presentaron una reactividad plaquetaria en el test de PRI-VASP superior a la de los pacientes de tipo silvestre (G/G) (el 72,3  11,9% frente al 56,1  18,8%; p = 0,02) (fig. 1A). De igual modo, se observó un PRI-VASP significativamente inferior en los portadores del alelo CYP2C19*17 */T en comparación con los pacientes de tipo silvestre (C/C) (el 51,3  17,8% frente al 63,8  18%; p = 0,048) (fig. 1B). Analizamos a los pacientes con riesgo alto de trombosis según el punto de corte que se ha propuesto en un reciente consenso para la reactividad plaquetaria durante el tratamiento con clopidogrel en el contexto de la ICP12. En nuestra población, 26 (65%) y 29 (72,5%) pacientes presentaron una elevada reactividad plaquetaria residual, según las determinaciones realizadas con la agregación inducida por ADP y con el PRI-VASP, respectivamente. A pesar del bajo número de pacientes evaluados, los dos métodos utilizados para valorar la reactividad plaquetaria residual mostraron 60 40 20 0 GG CT + TT C/C frente a */T Figura 1. Efecto del genotipo CYP2C19 en el test ı́ndice de reactividad plaquetaria-fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores en pacientes tratados con una intervención coronaria percutánea e implantación de stent. A: efecto de la variante alélica CYP2C19*2. B: efecto de la variante alélica CYP2C19*17. Los valores de fosforilación de fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores se evaluaron por citometrı́a de flujo en sangre total citrada mediante un test comercial, tal como se describe en el apartado «Métodos». Los recuadros indican el intervalo intercuartı́lico. La lı́nea continua corresponde a la mediana, y los lı́mites inferior y superior indican los percentiles 2 y 98. PRI-VASP: ı́ndice de reactividad plaquetaria-fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores. A. Tello-Montoliu et al / Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 223 Tabla 3 Efecto de los genotipos CYP2C19*2 y CYP2C19*17 en la prevalencia de pacientes de alto riesgo, según la elevada reactividad plaquetaria residual durante el tratamiento con clopidogrel Polimorfismo CYP2C19*2 Pacientes, n (%) LTA-ADP (5 mM)  46%, n (%) PRI-VASP  50%, n (%) 18 (58,1) 8 (88,9) 0,091 20 (74,1) 6 (46,2) 0,084 20 (64,5) 9 (100) 0,036 22 (81,5) 7 (53,9) 0,074 13 7 5 1 14 8 6 1 CYP2C19*17 A G/G */A p - - 31 (77,5) 9 (22,5) C/C */T p 27 (67,5) 13 (32,5) G/G */A G/G */A C/C C/C */T */T 19 8 12 1 B (47,5) (20) (30) (2,5) (68,4) (87,5) (41,7) (100) 26 (65) Total (73,7) (100) (50) (100) 29 (72,5) LTA-ADP: agregación óptica máxima inducida con adenosina difosfato; PRI-VASP: ı́ndice de reactividad plaquetaria-fosfoproteı́na estimulada por vasodilatadores. Los efectos de cada alelo polimórfico en las pruebas de la función plaquetaria se han evaluado de dos formas: A, efecto individual de cada polimorfismo, y B, combinación de ambos polimorfismos. Los datos se presentan como recuentos (porcentaje de casos). Se clasificó a los pacientes incluidos en el estudio del primer objetivo como «pacientes de alto riesgo» cuando la agregación máxima inducida por adenosina difosfato 5 mM era  46% o cuando los valores de PRI-VASP eran  50% según los puntos de corte establecidos por Bonello et al12 en un reciente consenso. Se comparó la prevalencia de pacientes de alto riesgo en portadores y no portadores de las variantes alélicas con la prueba de la x2. tendencia a una mayor representación de pacientes con aumento de la reactividad plaquetaria durante el empleo de clopidogrel en los portadores del alelo CYP2C19*2 */A, mientras que el estado de portador del alelo CYP2C19*17 */T mostró el efecto contrario (tabla 3). Segundo objetivo. Trascendencia pronóstica de los polimorfismos CYP2C19*2 */A y *17 */T Debido a la interrupción temprana del tratamiento con clopidogrel en 65 de los casos incluidos, finalmente 428 pacientes Tabla 4 Caracterı́sticas basales de los pacientes con sı́ndrome coronario agudo sin elevación del segmento ST reclutados para el estudio del segundo objetivo según el genotipo CYP2C19 Variable Pacientes, n (%) CYP2C19*2 CYP2C19*17 Total G/G */A C/C */T 308 (72) 120 (28) 283 (66,1) 145 (33,9) 428 (100) Edad (años) 67,3  12 67,3  12,8 67,3  12,2 67,3  12,2 67,3  12,2 Edad  65 años (%) 65,6 58,3 65 60,7 63,6 Varones (%) 64,3 66,7 66,4 62,1 65 Hipertensión (%) 68,1 75 68,8 72,4 70 Dislipemia (%) 55,2 53,3 54,8 54,5 54,7 Diabetes mellitus (%) 42,7 41,7 40,1 46,9 42,4 Tabaquismo (%) 22,4 21 23,4 19,3 22 Al menos 3 FRCV (%) 39,2 40 37,7 42,8 39,4 Depresión del segmento ST (%) 37,8 44,2 42,9 33,1 39,6 Troponina T  0,1 ng/ml (%) 59,2 59,8 60,6 56,9 59,3 Lesión significativa (%) 30,2 31,3 29,9 31,7 30,5 Sı́ntomas de angina grave (%) 29,4 37,4 29,2 36,4 31,6 Puntuación TIMI Tratamiento durante la hospitalización Cateterismo Con stent Sin stent Bypass arterial coronario 3,2  1,5 71,3 46 25,3 10,1 Tratamiento durante el periodo de seguimiento a 6 meses AAS 96,4 100 Clopidogrel Bloqueadores beta 86,8 IECA 55,3 28,1 Nitratos ARA-II 14,2 20,1 Antagonistas del calcio 89,5 Estatinas 3,4  1,6 3,2  1,5 3,2  1,6 3,2  1,5 75,2 44,6 30,6 14,4 75,7 48,3 27,4 11,7 66 40,7 25,3 10,4 72,4 45,6 26,8 11,2 95,8 100 90,9 50 39,6 22,7 20,4 90,9 95,4 100 90 56,9 36 18 22,3 92 97,9 100 83,3 46,9 21 13,5 15,6 85,4 96,3 100 87,9 53,7 31 16,6 20,2 89,9 AAS: ácido acetilsalicı́lico; ARA-II: antagonistas de los receptores de la angiotensina II; FRCV: factores de riesgo cardiovascular; IECA: inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina; lesión significativa: estenosis coronaria  50%. Edad y puntuación TIMI se expresan como media  desviación estándar. A. Tello-Montoliu et al / Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 Tabla 5 Análisis de regresión de Cox para los eventos adversos (sı́/no) en un seguimiento de 6 meses, según el genotipo y los factores de la puntuación de riesgo TIMI (segundo objetivo) Variable Análisis univariable CYP2C19*2; */A frente a G/G CYP2C19*17; */T frente a C/C Sexo femenino Edad  65 años Tres o más factores de riesgo cardiovascular Estenosis coronaria  50% Depresión del segmento ST Ácido acetilsalicı́lico previo Sı́ntomas de angina grave Troponina T  0,1 ng/ml Puntuación de riesgo TIMI Análisis multivariable Sexo femenino Edad  65 años Estenosis coronaria  50% Depresión del segmento ST Ácido acetilsalicı́lico previo Sı́ntomas de angina grave HR (IC95%) p 1 0,93 1,62 2,45 1,28 (0,94-1,55) (0,61-1,43) (1,09-2,42) (1,50-4,01) (0,86-1,91) 0,984 0,753 0,018 < 0,001 0,225 1,40 1,68 1,40 1,60 1,34 1,41 (0,91-2,10) (1,13-2,51) (0,92-2,10) (1,04-2,50) (0,87-2,05) (1,23-1,62) 0,132 0,011 0,113 0,034 0,182 < 0,001 1,29 2,52 1,47 1,63 1,10 1,56 (0,82-2,02) (1,44-4,42) (0,88-2,46) (1,05-2,53) (0,66-1,82) (1-2,42) 0,272 0,001 0,138 0,028 0,722 0,051 HR: hazard ratio; IC95%: intervalo de confianza del 95%. El grupo de referencia utilizado para calcular la interacción entre el alelo subyacente de *2 y *17 en el análisis univariable fue la variante del alelo de tipo silvestre. A Supervivencia acumulada fueron recomendados por sus cardiólogos y se los evaluó en nuestro estudio. Las caracterı́sticas demográficas y basales de estos 428 pacientes se detallan en la tabla 4. La media de edad fue 67,3  12,2 años; 278 (65%) eran varones y 150 (35%), mujeres. Respecto a la forma de presentación del SCASEST, el 39,6% de los pacientes incluidos presentaron depresión del segmento ST y el 59,3%, un aumento de los valores de troponina T (por encima del lı́mite estándar). La media de puntuación de riesgo TIMI para el conjunto de la cohorte fue 3,22  1,54. Las distribuciones genotı́picas fueron las siguientes: el 71,96% G/G, el 24,77% G/A y el 3,27% A/A para el polimorfismo CYP2C19*2, y el 66,12% C/C, el 30,14% C/T y el 3,74% T/T para el CYP2C19*17. Para la distribución de los genotipos, no se observó ninguna desviación significativa del equilibrio de HardyWeinberg (p = 0,527 y p = 0,905, respectivamente). Ası́ pues, hubo 120 pacientes portadores del alelo CYP2C19*2 */A (28%) en nuestra población, y 145 portadores del alelo CYP2C19*17 */T (33,9%) (tabla 4). Tal como se indica, no hubo diferencias significativas (p > 0,05) en las caracterı́sticas demográficas y basales, la medicación y el manejo de los pacientes, independientemente del genotipo (tabla 4), con la excepción de las diferencias significativas en la depresión del segmento ST en los portadores del alelo CYP2C19*17 (p = 0,05), ası́ como en la frecuencia de cateterismos (sin significación estadı́stica en las tasas de implantación de stents) y de la prescripción de nitratos (p = 0,034 y p = 0,037, respectivamente). Se dispuso de datos completos de seguimiento a 6 meses en 412 (96,3%) de los 428 pacientes incluidos. De ellos, 97 (23,5%) presentaron eventos adversos en este periodo de seguimiento. El análisis univariable de la regresión de Cox (tabla 5), demostró que el estado de portador del alelo de pérdida de función CYP2C19*2 (*/A) no era un predictor significativo de evolución adversa ([HR (IC95%): 0,99 (0,64-1,55)], p = 0,984). Tampoco el alelo de ganancia de función CYP2C19*17 (*/T) mostró significación estadı́stica en la reducción de la frecuencia de los eventos adversos durante los 6 meses de seguimiento ([HR (IC95%): 0,75 (0,61-1,43)], p = 0,753). Tal como se muestra en la figura 2, la supervivencia acumulada en este breve periodo de seguimiento no se vio significativamente influida por el genotipo CYP2C19, según el análisis univariable (tabla 5). En cambio, varios de los factores de riesgo utilizados para el cálculo de la puntuación de riesgo TIMI mostraron influencia estadı́sticamente significativa en los resultados clı́nicos en el 1 Genotivo CYP2C19*2 GG GA + AA 0,8 0,6 Log rank (Mantel-Cox), p = 0,984 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 Días B Supervivencia acumulada 224 1 Genotipo CYP2C19*17 CC GT + TT 0,8 0,6 Log rank (Mantel-Cox), p = 0,753 0,4 0,2 0 0 50 100 150 200 Días Figura 2. Curvas de Kaplan-Meier para los portadores y no portadores de alelos CYP2C19 *2 y *17 con seguimiento de 6 meses. A: supervivencia acumulada para los portadores del alelo CYP2C19*2 (GA + AA, lı́nea discontinua) y los no portadores (GG, lı́nea continua). B: supervivencia acumulada para los portadores del alelo CYP2C19*17 (TC + TT, lı́nea discontinua) y los no portadores (CC, lı́nea continua). análisis univariable; por ejemplo, la edad  65 años, las anomalı́as electrocardiográficas con depresión del segmento ST y los sı́ntomas graves de angina (tabla 5). De hecho, la puntuación de riesgo TIMI resultó ser un potente predictor de la evolución clı́nica adversa en el conjunto de la población ([HR (IC95%): 1,41 (1,23-1,62)], p < 0,001). Además, el sexo femenino mostró una asociación significativa con la evolución clı́nica adversa ([HR (IC95%): 1,62 (1,09-2,42)], p = 0,018). No obstante, en el análisis multivariable, solamente la edad  65 años y las anomalı́as electrocardiográficas con depresión del segmento ST continuaron mostrando una asociación significativa con la evolución clı́nica adversa a los 6 meses de seguimiento (p = 0,001 y p = 0,028, respectivamente) (tabla 5). Se demostró tendencia a una mala evolución clı́nica en relación con los sı́ntomas graves de angina en las 24 h previas (p = 0,051). DISCUSIÓN Las discrepancias descritas en la reactividad plaquetaria durante el tratamiento con clopidogrel y el impacto de los polimorfismos CYP2C19*2 y *17 deben estar relacionados con el número de pacientes evaluados, pero también con el hecho de que la prueba de PRI-VASP evalúa especı́ficamente la función del receptor P2Y12 y parece ser más sensible para evaluar los efectos biológicos de clopidogrel según el estado del CYP2C19 (tabla 3), a diferencia de la agregación plaquetaria13 inducida por ADP y A. Tello-Montoliu et al / Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 mediada por los receptores P2Y en la agregometrı́a óptica. Además, la baja correlación entre las diversas pruebas de la función plaquetaria14,15 parece variar en función de factores subyacentes que deben influir en la elevada reactividad plaquetaria residual16. Muchos estudios han demostrado una asociación significativa del CYP2C19*2 con un mal pronóstico clı́nico3,4,17. Nuestros datos sugieren que, en pacientes con riesgo trombótico moderado, ya que menos del 50% recibió ICP7,18 e implantación de stent, la repercusión clı́nica de un único polimorfismo debe reducirse18. Otros estudios han demostrado que los eventos isquémicos y la trombosis de stent ocurren pronto tras el inicio del tratamiento con clopidogrel en asociación con la ICP y la implantación del stent3,4,18,19. Los pacientes a los que se practica una ICP deben mostrar un estado de reactividad plaquetaria diferente20. De hecho, muchos estudios han encontrado asociaciones positivas cuando se practicó ICP a más del 70% de los pacientes3–5,19, independientemente del pequeño tamaño muestral2,19. Por el contrario, para porcentajes de ICP menores (el 18% ICP, el 15,5% con stents), el análisis genético del test Clopidogrel in Unstable Angina to prevent Recurrent Events (CURE)7 no encontró asociación significativa entre la presencia de alelos polimórficos CYP2C19*2 (*2/*2, *2/*3 y *3/*3) y la ocurrencia de eventos adversos. La diabetes mellitus se ha asociado con hiperreactividad plaquetaria y, junto con el polimorfismo CYP2C19*2, es el mejor factor discriminatorio para explicar la respuesta insuficiente a clopidogrel21. No obstante, los resultados de un reciente metaanálisis, en el que el 91% de los pacientes habı́an sido tratados con ICP, indican que el impacto de la presencia del alelo CYP2C19*2 se asocia a un riesgo elevado de un resultado clı́nico adverso, en mayor medida que otros factores clı́nicos5. En consonancia con estos resultados, la diabetes mellitus fue más frecuente (42,4%) en nuestra población que en otras (23-28%)5,18. Sin embargo, en nuestra población, la mayor prevalencia de diabetes mellitus no parece ser suficiente para elevar significativamente el riesgo de los portadores del alelo *2, a pesar de que se combine con una frecuencia de ICP cercana al 70% y una tasa de implante de stent de casi un 50%. Ası́ pues, la ICP y la implantación de stents, más que otras condiciones clı́nicas, deben considerarse factores de alto riesgo trombótico en pacientes portadores del alelo CYP2C19*2 */A doblemente antiagregados. En consecuencia, debemos ser muy cautos al definir «poblaciones de alto riesgo» dependiendo del escenario clı́nico subyacente. Aun ası́, el estado del alelo CYP2C19*2 sólo explica un 5-15,2% de la heterogeneidad de respuesta al clopidogrel2. Por otro lado, la trascendencia clı́nica del estado de portador del CYP2C19*17 todavı́a está por esclarecer. Algunos estudios han relacionado este polimorfismo con una mayor respuesta al clopidogrel7 y un incremento del riesgo hemorrágico18,22. Hay poco consenso acerca de un posible efecto neutro6 o protector respecto a la ocurrencia de eventos isquémicos22,23. Nuestros resultados no indican una interacción significativa entre el estado del alelo *17 y los eventos adversos, a pesar de que se registraron tasas más bajas de cateterismo en los portadores del alelo *17 que en los no portadores (el 66 frente al 75,7%; p = 0,034), probablemente debido al riesgo moderado de nuestra población. Los estudios con resultados positivos que asocian el polimorfismo CYP2C19*17 con una reducción en la tasa de eventos adversos se basan en un número bajo de pacientes tratados con ICP (18%)7 e implantación de stent (15,5%). No obstante, las tasas más altas de ICP (90-100%) se asocian a ausencia de reducción de los eventos isquémicos, independientemente del estado del alelo CYP2C19*174,6. El test PLATO podrı́a ser comparable al nuestro, dada la frecuencia de ICP (66%), pero sólo aporta información acerca de la asociación entre el alelo *17 y el riesgo hemorrágico18. Ası́ pues, en pacientes con un riesgo trombótico moderado o mayor, el efecto clı́nico «protector» del CYP2C19*17 debe ser 225 inferior. Lamentablemente, no registramos las tasas de hemorragia en nuestros pacientes para explorar la influencia de estos polimorfismos en las posibles complicaciones hemorrágicas4,6,7,18 en nuestra cohorte. La elevada variabilidad interindividual de respuesta al clopidogrel continúa siendo una cuestión clı́nicamente relevante24–27. A pesar de que se ha demostrado que esta heterogeneidad es un proceso multifactorial24,25,28,29, diversos estudios han señalado la existencia de una relación entre el genotipo CYP2C19 y las consecuencias pronósticas30–32. Sin embargo, el sexo femenino (35%) se ha asociado a eventos adversos, según los resultados de Mega et al5. La trascendencia pronóstica individual debe depender del contexto clı́nico21,33. Las caracterı́sticas demográficas y basales, junto con el estado del CYP2C1919,21,33,34, en nuestra cohorte (el 42,2% diabetes, el 35% sexo femenino y el 45,6% implantación de stents) pueden explicar, al menos en parte, la tendencia (aunque sin significación estadı́stica) de las curvas de supervivencia de KaplanMeier. El fenotipo es el resultado de la combinación del genotipo y el ambiente donde se expresa, lo que debe ser la variable más importante en la enfermedad cardiovascular21,33. Limitaciones En primer lugar, observamos una gran incidencia de elevada reactividad plaquetaria residual en los pacientes estudiados para el primer objetivo, y ello puede ser una limitación para alcanzar diferencias significativas en función del genotipo en las pruebas de función plaquetaria por agregometrı́a óptica. No encontramos una explicación clara para estos resultados. Sin embargo, una tasa más elevada de uso de stents farmacoactivos, relacionada con una cicatrización de la neoı́ntima defectuosa en las arterias coronarias, puede estar relacionada con una mayor reactividad plaquetaria. En segundo lugar, el tamaño muestral de ambas poblaciones fue pequeño y se basó en el número máximo de pacientes que aceptaron participar. No podemos descartar que la potencia estadı́stica fuera insuficiente, como ha ocurrido en estudios previos18. La prevalencia alélica fue muy similar a la de otros estudios3–7, con el 3,3 y el 3,7% de A/A (CYP2C19*2) y T/T (CYP2C19*17), respectivamente. Además, evaluamos poblaciones enteramente caucásicas; por consiguiente, nuestros resultados deben ser especı́ficos para nuestras poblaciones de pacientes y la forma en que los tratamos. Por consiguiente, nuestro estudio podrı́a subestimar la influencia de los polimorfismos genéticos en los efectos de clopidogrel en nuestro contexto especı́fico. Además, la mayorı́a de los estudios en que se ha evaluado el impacto del CYP2C19 han tenido periodos de seguimiento más largos; nosotros realizamos un seguimiento relativamente corto, de 6 meses, similar al de un estudio previo5. Estudiamos tan sólo los dos polimorfismos más comúnmente asociados con la evolución clı́nica; sin embargo, hay otros alelos o factores basales/demográficos que pueden ser relevantes para cada caso particular. Otra limitación en el segundo objetivo es el breve periodo de seguimiento. El hecho de que no se evaluara el cumplimiento de la terapia con clopidogrel en la población del segundo objetivo también puede ser una limitación. Por último, el empleo de dos poblaciones diferentes impide establecer asociaciones entre la reactividad plaquetaria durante el tratamiento, los eventos cardiovasculares y el estado de portador del alelo CYP2C19. CONCLUSIONES Las variantes alélicas CYP2C19*2 */A y CYP2C19*17 */T se asocian significativamente a un aumento y una disminución, A. Tello-Montoliu et al / Rev Esp Cardiol. 2012;65(3):219–226 226 respectivamente, de la reactividad plaquetaria durante el tratamiento con clopidogrel, al evaluar el efecto especı́fico de este fármaco en el P2Y12. Sin embargo, el estado de portador del CYP2C19 ha mostrado una influencia poco consistente en los eventos adversos en pacientes con SCASEST no seleccionados de riesgo moderado en un periodo de seguimiento de 6 meses. Estas poblaciones deben estar más influidas por otros factores clı́nicos/demográficos. Debe haber un beneficio diferente asociado al tratamiento con clopidogrel en la prevención de eventos adversos tales como la trombosis del stent y la recurrencia del sı́ndrome coronario agudo. La trombosis arterial podrı́a verse influida por multitud de variables. Los resultados obtenidos mediante un determinado test deben interpretarse con precaución en función de los diferentes contextos clı́nicos. FINANCIACIÓN Este estudio ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III (RECAVA RD 06/0014-0039), la Fundación Séneca (07703/GERM/ 07), y la Beca Fundación Uriach-Sociedad Española de Cardiologı́a 2009. CONFLICTO DE INTERESES Ninguno. BIBLIOGRAFÍA 1. Kazui M, Nishiya Y, Ishizuka T, Hagihara K, Farid NA, Okazaki O, et al. Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite. Drug Metab Dispos. 2010;38:92–9. 2. Bouman HJ, Harmsze AM, Van Werkum JW, Breet NJ, Bergmeijer TO, Ten Cate H, et al. Variability in on-treatment platelet reactivity explained by CYP2C19*2 genotype is modest in clopidogrel pretreated patients undergoing coronary stenting. Heart. 2011;97:1239–44. 3. 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