Desnaturalización / renaturalización del ADN

Espero que te hayas tomado un tiempo para reflexionar sobre la estructura del ADN de Watson Crick. Repasemos los enlaces de la hélice de ADN antes de hablar sobre las implicaciones de su estructura. Cada uno de los hilos se mantiene unido por enlaces covalentes.

A cada lado de los azúcares en la columna vertebral hay un fosfato.

Los enlaces los azúcares juntos. Estos son enlaces muy fuertes. Los dos hilos se mantienen unidos por enlaces no covalentes: eso es decir, los enlaces de hidrógeno entre las bases y el apolar, y las interacciones de apilamiento proporcionan la energía que mantiene los dos hebras en forma de doble hélice.

Es posible interferir con estas interacciones no covalentes y para separar las hebras de ADN para que ahora tengas hebras individuales, No en la doble hélice. Este proceso se llama desnaturalización. Para hacer que la estructura del ADN no sea nativa, ellos desnaturalización de una estructura helicoidal a polímeros lineales de nucleótidos como se indica en la imagen. Se puede usar calor o productos químicos para interferir con los enlaces de hidrógeno y separe los hilos, pero cuando invierte las condiciones (menor la temperatura, eliminar el químico), las dos cadenas complementarias se reasociará, y este proceso se llama renaturación, y entonces vuelves a la forma nativa bicatenaria.

La temperatura a la cual los hilos se separarán o volverán a unirse, refleja qué tan bien se emparejan los pares de bases a lo largo de la secuencia, y también es un reflejo del contenido de los pares GC. Esa temperatura se llama temperatura de fusión o temperatura del punto medio Tm, y es una medida de la estabilidad del ADN. Entonces, ¿por qué un mayor contenido de GC aumentaría la Tm?

Y es porque hay tres enlaces de hidrógeno para pares de bases GC y solo dos para pares de bases AT. Entonces, los pares GC hacen que la molécula sea más estable. Y así, cuanto mayor sea el contenido de GC, mayor será la temperatura de fusión. No solo puedes desnaturalizar y renaturalizar un ADN originalmente era una sola hélice, pero puedes desnaturalizar y mezclar ADN de diferentes fuentes. Ese proceso se llama hibridación. La hibridación se puede usar para comparar secuencias de ADN. Digamos que tomas ADN de dos organismos y separas las hebras. Desnaturalizas el ADN. Luego, mezclas y permites que los hilos se renaturen. Algunas hebras de una especie se revitalizarán con hebras de otra, creando una molécula de ADN híbrido.

La estabilidad de esa molécula indica qué tan relacionadas están las secuencias. Es decir, cuántos de los pares de bases en el híbrido alinearse y formar enlaces de hidrógeno. Las X en la figura indican dónde no se formaron los enlaces de hidrógeno. Las dos especies más estrechamente relacionadas, con frecuencia cuanto más similares son las dos secuencias. Entonces tienen un mal emparejamiento más bajo y una Tm más alta. Esta es una forma común que fue históricamente usado para determinar la similitud entre dos secuencias. Hoy solo secuenciamos ambos ADN, pero la hibridación sigue siendo importante porque se usa en métodos que involucran ADN.

Entonces, si tiene una similitud de secuencia significativa, puede obtener la hibridación. Ese nivel de similitud a menudo está presente para los genes que producen proteínas que son esenciales en múltiples especies. Podemos tomar ADN monocatenario para un gen particular y podemos sondear una mezcla de ADN monocatenario Moléculas aisladas de un organismo. Si hacemos esto a alta temperatura, seleccionamos para un emparejamiento de bases estricto, es decir, cuanto mayor sea la temperatura, más pares de bases Necesidad de forma para la estabilidad. Pero a temperaturas más bajas puede formar ADN bicatenario con bases mal emparejadas o no forman pares de bases en cada posición a lo largo de la secuencia. Esto nos permite comparar secuencias.


​La hibridación refleja la similitud de las secuencias. Y esta capacidad de usar la temperatura para comparar la hibridación. Tiene múltiples aplicaciones modernas. Vamos a pasar por uno de esos que Permite la detección de secuencias específicas. Además, la capacidad de sintetizar ADN fue un avance transformacional. Como podemos sintetizar secuencias específicas, a veces podemos saber exactamente qué secuencia hay en una muestra de ADN. Puede diseñar oligonucleótidos, hechos por síntesis química, ofreciendo una gran variedad de oportunidades, incluida la que estamos voy a hablar de ahora Puedes hacer segmentos cortos de ADN etiquetados con un fluoróforo, entonces tiene fluorescencia que puedes detectar, y puedes explorar esa secuencia en múltiples ADN al permitir que el ADN marcado hibridice con el ADN que está probando.

Cuando haces eso, formas un híbrido que está marcado por el fluoróforo. En conjunto, podemos describir una descripción simple del proceso para microarrays. Hay aplicaciones más complejas de esto, por supuesto. Pero comenzamos con secuencias cortas de ADN que se sintetizan y usar la impresión robótica para colocarlos en una matriz donde sabemos cuáles son las secuencias en cada posición de la matriz. Ahora tomamos ADN de dos fuentes diferentes. Podemos etiquetar esos ADN con una base fluorescente en su final Cy3- o Cy5-dCTP. Cy3 y Cy5 son fluoróforos que tienen diferente absorbancia y emisión de fluorescencia, para que pueda distinguirlos. Con este ADN marcado, hibridamos con una sonda. Lavaremos el ADN no unido para que el único fluoróforo que quede está unido al ADN que ahora se hibrida con una secuencia en la matriz.

​Utilizamos láseres de dos longitudes de onda diferentes, donde cada uno se ilumina solo uno de los fluoróforos, y combinamos las imágenes producidas para ver qué secuencias de ADN impreso en la matriz hibridada con las muestras de ADN. Y esto nos dice qué secuencias estaban presentes en esas muestras de ADN. Los microarrays detectan secuencias definidas basadas en patrones de hibridación. Puede usar segmentos cortos de ADN u oligonucleótidos que están inmovilizados en un patrón definido en un material de soporte, como una placa de 96 pocillos, diapositiva o chip. La misma disposición de matriz puede usarse para sondear múltiples secuencias de ADN. Y este método le permite detectar secuencias tanto visualmente y espectrofotométricamente. Algunas matrices son muy complejas y pueden probar muchas secuencias a la vez.

Puede ver desde esta matriz que se destaca de la matriz compleja. Muestra los puntos individuales de una matriz más grande. donde están contenidas miles de secuencias. Los datos se analizan para determinar qué muestras en la matriz son capaces de formar un híbrido en cada posición de la matriz. El análisis computacional complejo puede permitir tomar grandes volúmenes de estos datos. e interpretándolo. Entonces, la hibridación es la clave en estos microarrays. ¿Por qué crees que los microarrays son un método tan popular para examinar el ADN? Y con algunas modificaciones también son útiles para examinar el ARN.

¿Qué tipo de experimentos podría tener este método? permitir que de lo contrario sería difícil?

Fabricación de chips genéticos

La forma de hacerlo es usando uno de estos dispositivos interesantes. Estos son microarrays de ADN; Vienen en diferentes sabores y formas. Están hechas por tecnologías algo diferentes y por diferentes compañías y laboratorios académicos. Elegí uno aquí que viene en un paquete muy agradable. Esto tiene una pequeña astilla de vidrio, un pequeño cuadrado de vidrio, en el que en esos pequeños cuadrados que ves en la diapositiva, cada cuadrado tiene una secuencia de ADN diferente. 

Hay una secuencia de ADN específica de 25 letras en ese cuadrado, y una secuencia de ADN de 25 letras diferente en ese cuadrado, y una diferente en ese cuadrado y una diferente en ese cuadrado. Cada uno de estos tiene cualquier secuencia de ADN que le gustaría especificar. Puede escribirlos y alguien puede hacer una matriz de ADN que contenga diferentes secuencias de 25 letras. 

¿Cómo puedes hacer eso? 

Ahora supongo que podrías ir al laboratorio químico y sintetizar el primero, y luego venir y pegarlo. Luego sintetice el siguiente y péguelo, y el siguiente y péguelo. Pero en realidad la forma en que lo hacen es hacerlo en paralelo. Lo hacen de la misma manera que las personas hacen chips de microprocesador en Silicon Valley. 

Tienen una máscara, iluminan el cristal. Donde brilla la luz, la superficie se desprotege y puede lavarse en una de las letras de ADN. Luego vuelve a proteger la superficie, ilumina la luz a través de otra máscara, desprotege ciertos puntos y se lava en la siguiente letra. Brille la luz a través de una máscara, lávese otra letra y da.da.da.da.da. Luego sintetice el siguiente y péguelo, y el siguiente y péguelo. Pero en realidad la forma en que lo hacen es hacerlo en paralelo. Lo hacen de la misma manera que las personas hacen chips de microprocesador en Silicon Valley. 

Donde brilla la luz, la superficie se desprotege y puede lavarse en una de las letras de ADN. Luego vuelve a proteger la superficie, ilumina la luz a través de otra máscara, desprotege ciertos puntos y se lava en la siguiente letra. Brille la luz a través de una máscara, lávese otra letra y da.da.da.da.da. Después de cien de estas máscaras, puede acumular un promedio de aproximadamente 25 letras específicas en cada lugar. Y dependiendo de si en cada máscara, tenía negro o claro, puedes activar o no activar cada punto y construir una secuencia específica de letras de ADN en cada punto.