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Aglutinación
- 2. 2 Indice Introducción………………………………………………………………….. 3 Métodos cualitativos…………………………………………………………. 4 Valoración de antisueros……………………………………………………. 5 Valoración de anticuerpos “incompletos”………………………………… 6 Aglutinación pasiva………………………………………………………….. 6 Bibliografía…………………………………………………………………… 9
- 3. 3 Introducción Se denomina aglutinación a la interacción secundaria in vitro de un antígeno “particulado” con su anticuerpo específico. Si el antígeno (proteína, hidrato de carbono, etc.) se encuentra presente en la superficie de células, bacterias u otras partículas naturales el fenómeno se denomina aglutinación directa. Cuando el antígeno con el que interacciona el anticuerpo específico no forma parte de la estructura nativa de la partícula, sino que se incluye artificialmente en su superficie, la aglutinación que tiene lugar se denomina genéricamente aglutinación pasiva o indirecta. Las partículas utilizadas como soportes pueden ser inertes (partículas de látex) o bien glóbulos rojos, en cuyo caso el método recibe el nombre de hemoaglutinación pasiva o indirecta. La aglutinación pasiva se denomina “directa” cuando se inmoviliza el antígeno a la partícula inerte o “reversa” cuando se inmoviliza el anticuerpo. A bajas diluciones del suero la aglutinación puede estar ausente, debido a un exceso de moléculas de anticuerpo, este fenómeno se denomina efecto de prozona. Las metodologías de aglutinación son ampliamente utilizadas en el laboratorio clínico para la detección serológica de anticuerpos en diferentes patologías infecciosas y para la tipificación de grupos sanguíneos. Es importante recordar que el anticuerpo a investigar por aglutinación debe ser por lo menos funcionalmente bivalente. Aquellos anticuerpos que poseen un solo paratope útil de alta afinidad se denominan anticuerpos incompletos o asimétricos (funcionalmente monovalentes). Para poder evidenciarlos utilizando reacciones de interacción secundaria es necesario recurrir a otras pruebas como la reacción de Coombs. Ésta se utiliza frecuentemente, entre otras aplicaciones, para la detección de anticuerpos anti-Rh (anti- antígeno D) en el suero de pacientes Rh negativo. Esta reacción se basa en la aglutinación de anticuerpos anti-inmunoglobulina humana (suero de Coombs) para
- 4. 4 producir la aglutinación luego de la interacción del antígeno con los anticuerpos incompletos. Métodos cualitativos Son muy utilizados en serología diagnóstica con el objeto de identificar bacterias, en las determinaciones de grupos sanguíneos, etc. Estas reacciones se efectúan en portaobjetos mezclando suspensiones de las bacterias o hematíes para identificar con antisueros diferentes. La formación de grumos indicará la especificidad del sistema reaccionante.
- 5. 5 Valoración de antisueros Los métodos son semicuantitativos y consisten en determinar cuál es la máxima dilución del suero para analizar capaz de aglutinar al antígeno específico. Las diluciones generalmente se hacen en razón 2 y el título se expresa por la inversa de la máxima dilución aglutinante. Si la dilución 1/1024 aglutina y no lo hace la dilución 1/2048, el título será 1024. Es una metodología de singular importancia diagnóstica, ya que, efectuada en forma seriada, la variación del título de anticuerpos puede ser muy útil para seguir la evolución de una infección bacteriana o de una isosensibilización por antígenos hemáticos. Título = inversa de la máxima dilución aglutinante Fenómeno de prozona: cuando se valora un antisuero, la disminución de los anticuerpos por dilución hace que decrezca la aglutinación hasta hacerse nula. No obstante ello, en algunos sueros se observa un comportamiento particular, caracterizado por ausencia de aglutinación en los primeros tubos de la serie, en los que la concentración de anticuerpos es máxima, con aglutinación positiva a diluciones mayores. A este fenómeno se lo llama prozona. Existiendo un marcado exceso de anticuerpo con respecto a los determinantes antigénicos de la superficie celular, estadísticamente es muy poco probable que los dos sitios activos del anticuerpo puedan unirse a grupos receptivos específicos ubicados en células diferentes.
- 6. 6 Valoración de anticuerpos “incompletos” Estos anticuerpos, además de no aglutinar, al ser puestos en presencia de las correspondientes partículas antigénicas las bloquean e impiden su aglutinación por el anticuerpo específico bivalente. Su investigación y valoración son muy corrientes en clínica hematológica, en especial en isosensibilizaciones maternofetales por antígenos del sistema Rh. Su valoración puede hacerse por el método de Coombs: para esta determinación es necesario disponer de un antisuero específico contra la gammaglobulina de la especie animal de la que provienen los anticuerpos que se han de investigar. Si los anticuerpos bloqueantes fuesen humanos, la antigammaglobulina (suero de Coombs) será específica para la gammaglobulina humana. El método consiste en mezclar el antígeno con diluciones del suero que contiene los anticuerpos “incompletos” e incubar las mezclas a 37 °C durante una hora. Si bien no hay aglutinación, hay fijación del anticuerpo al antígeno, lo que significa que éste se cubre de moléculas de gammaglobulina. Si después de lavar tres veces con solución salina tamponada se añade a todos los tubos suero de Coombs, como éste es específico para los determinantes antigénicos de la gammaglobulina, en todos aquellos tubos en que exista anticuerpo “incompleto” fijado al antígeno habrá aglutinación. El título corresponderá a la inversa de la máxima dilución del suero en examen que de aglutinación. Aglutinación pasiva Cantidades de anticuerpos contra un antígeno soluble no pueden detectarse por precipitación si su concentración no excede los 20 µg/ml. Teniendo en cuenta que la aglutinación es más sensible se ha procurado fijar antígenos solubles a partículas, de modo de transformar la precipitación en aglutinación. A la reacción que resulta del empleo de glóbulos rojos como soporte se la llama hemaglutinación pasiva, y simplemente aglutinación pasiva cuando se utilizan otros. Generalmente las uniones de los antígenos a los soportes son no covalentes y la fijación se obtiene por mezcla directa o previo acondicionamiento de la superficie de las partículas. En el caso de los hematíes, la
- 7. 7 fijación de hidratos de carbono no necesita intermediarios; en cambio para las proteínas es necesario el tanado previo o tratamiento con aldehídos simples como el fórmico, pirúvico o glutárico. La aglutinación pasiva es un método semicuantitativo que permite determinar concentraciones relativas de anticuerpos sobre la base de la máxima dilución aglutinante. Es cuatro veces más sensible que la aglutinación y mucho más aún que la precipitación. Ello es consecuencia del tamaño de las partículas antigénicas que intervienen en la reacción. En la precipitación, el antígeno es molecular y se necesitan muchos complejos antígeno-anticuerpo agregados para que la reacción se visualice, en tanto que en la aglutinación pasiva se lo ha transformado en una partícula de gran tamaño, capaz de dar aglutinados con pocas de ellas. Esta técnica es muy utilizada en serología diagnóstica, ya sea bajo la forma de aglutinación pasiva directa o midiendo su inhibición. Esto sirve para investigar hormonas y antígenos solubles diversos en sangre, orina y otros fluidos y especialmente para el diagnóstico temprano del embarazo, puesto que en estos casos hay marcado aumento de gonadotrofina urinaria: si se mezcla un antígeno constituido por partículas inertes a las que se les ha fijado la gonadotrofina y suero antigonadotrofina bivalente, habrá aglutinación. Mezclando dicho suero con la orina a analizar, en caso de que esta contenga gonadotrofina, el anticuerpo será neutralizado, y si luego se añade el antígeno fijado al soporte inerte, no habrá aglutinación. Ello significa que el anticuerpo fue totalmente neutralizado en la primera etapa y que por lo tanto la concentración de gonadotrofina urinaria es alta, lo que permite hacer diagnóstico temprano de embarazo.
- 9. 9 Bibliografía Guía de Trabajos Prácticos: Inmunología Ciclo Superior Bioquímica; Facultad de Farmacia y Bioquímica. Inmunología e Inmunoquímica. Margni y col. 5° Ed., 1996. Editorial Médica Panamericana (en español). Página Web http://www.slideshare.net/doctorrao/agglutination-tests-and- immunoassys Página Web http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-infecciosas- microbiologia-clinica-28-articulo-identificacion-rapida-icandida-dubliniensis-i- mediante-13111184