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  • Determinacion de Proteinas Segun Lowry

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    Eduardo Lobito
    128 vistas8 páginas
    Este documento describe el método de Lowry para la cuantificación de proteínas. El método involucra dos etapas: primero, los iones de cobre forman complejos con las proteínas, y segundo, el reactivo de Folin reduce los grupos fenólicos de las proteínas formando un complejo de color azul cuya intensidad depende de la concentración de proteínas. Se construye una curva de calibración estándar para determinar la concentración de proteínas en las muestras mediante espectrofotometría.

    Descripción original:

    lowry

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    Determinacion de Proteinas Segun Lowry

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    Este documento describe el método de Lowry para la cuantificación de proteínas. El método involucra dos etapas: primero, los iones de cobre forman complejos con las proteínas, y segundo, el reactivo de Folin reduce los grupos fenólicos de las proteínas formando un complejo de color azul cuya intensidad depende de la concentración de proteínas. Se construye una curva de calibración estándar para determinar la concentración de proteínas en las muestras mediante espectrofotometría.

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    de 8

    DETERMINACION DE PROTEINAS SEGUN LOWRY

    1.

    PRINCIPIO DEL METODO


    La cuantificacin de la concentracin de protenas en la biomasa se realiza con el mtodo colorimtrico
    de Lowry (Lowry et al., 1951) modificado por Peterson (1977). El principio del mtodo se basa en que
    ciertos amonio cidos como tirosina, triptfano y cistena reaccionan en un medio-alcalino con cido
    fosfotungstnico y cido molbdico del reactivo de Folin (color amarillo) para dar un complejo incoloro
    que se puede reducir mediante una reaccin lenta con fenol en un complejo de coloracin azul
    detectable por espectrofotometra entre 600 y 900 nm (con una absorbancia mxima a 740 nm).
    Esta coloracin se refuerza por el acomplejamiento de sulfato de cobre con los enlaces peptdicos de
    las protenas. La intensidad de la coloracin obtenida depende del nmero y de la naturaleza de los
    residuos que constituyen la protena presente en la muestra a analizar ya que a iguales
    concentraciones dos protenas diferentes no desarrollan la misma intensidad de color. (Figura 1)

    Figura 1. Esquema del proceso de obtencin protenas


    El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la
    muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad
    de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la Ley de Lambert-Beer.

    Este mtodo consta de dos etapas:


    1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de
    nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems,
    provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos
    fenlicos de tirosina que van a participar en la
    segunda etapa de la reaccin.
    El Cu2+, se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato.
    2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenlicos de
    los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador.
    El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color
    amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

    REACTIVOS
    A) (Solucin A) Solucin de Na2Co3 al 2% y tartrato de sodio y potacio al 0.02% en NaOH 0.1N.
    Na2Co3 (Carbonato de Sodio)
    2g-------- 100mL
    10g------- 500mL
    Tartrato de sodio y potacio
    0.02g-----100mL
    0.10g----- 500mL
    NaOH (Hidroxido de Sodio)
    40g------ 1N
    4.0----- 0.1N---- 1000mL
    2.0g----------------- 500mL
    B) (Solucin B) Solucin de CuSO4 al 0.5% en agua destilada.
    CuSO4 (Sulfato de Cobre)
    0.5g ------10mL
    1.25-------250mL
    C) Solucin cupro-alcalina, 50mL de la Solucin A con 1mL de la Solucin B.
    se prepara al momento de usarse
    D) Reactivo de folin-Ciocalteu diluido en una proporcion 1:1 en agua destilada
    E) Solucion estandar. Albumina bovina 0.3mg en 1mL de agua destilada
    CURVA ESTANDAR
    TUBO
    0
    1
    2
    3
    4
    5

    ASB
    (l) [ ]
    --- ----50---0.015
    1000.03
    1500.045
    2000-06
    250---0.075

    H2O
    (l)
    250
    200
    150
    100
    50
    ----

    SOL. C
    (Ml)
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    1.0
    *

    *Mezclar e incubar 10min a T.A


    ** Mezclar e incubar 45 minutos aT.A

    Leer a 550nm

    SOL.D
    (l)
    100
    100
    100
    100
    100
    100
    **

    Espectrofotometra:
    Los mtodos espectrofotomtricos se basan en la interaccin materia-energa. La radiacin EM interacciona
    con la materia produciendo algn efecto, se dice que materia absorbe energa. Se lleva la materia desde un
    estado fundamental a un estado excitado. Dependiendo de la cantidad de energa aplicada, la interaccin
    ocurrir a distintos niveles. Con ello se distinguen varios tipos de espectroscopia segn sea el tipo de
    interaccin con la REM:

    Para el caso de la espectrofotometra UV-visible la interracin ocurre a nivel de los e- de la capa de valencia
    existe un cambio en la distribucin electrnica.
    Absorcin UV-visble : Para que ocurra la absorcin de una radiacin UV-visible en molculas orgnicas, se
    requiere que la energa absorbida corresponda al salto de un orbital poblado a uno desocupado. En el caso
    molecular, los niveles no son tan discretos por lo que existe una gamma de frecuencias posibles.
    Absorcin y Emisin: Cuando se absorbe energa se pasa de un estado fundamental a un estado excitado.
    Este estado excitado vuelve a su estado basal luego de un cierto periodo de desfase, ocurriendo emisin de
    radiacin (no siempre puede ocurrir, la energa se puede disiparse de otras formas). Este fenmeno da origen
    a otro tipo de espectroscopa como la espectroscopia de luminiscencia, fluorescencia.

    Cada analito molecular tiene un mximo de absorcin en la zona del UV-visible. Atendiendo a esta para
    cada sustancia y a la intensidad en que se absorbe la radiacin se disea un mtodo para cuantificar la
    cantidad de sustancia .

    La cubeta: Recipente de la muestra

    Absorcin de la Luz

    Procedimiento experimental:

    Una vez que se tiene la muestra, se obtiene


    una solucin perfectamente disuelta y
    transparente que se coloca en la cubeta.
    En general se ocupan cubetas cuadradas de un
    cm de paso. Si la disolucin es muy diluida, se
    ocupa una cubeta ms ancha (mayor
    posibilidad de paso de luz y absorcin).
    Se ocupan cubetas de cuarzo (no absorbe
    radiacin visible ni UV)
    Los fenmenos pticos (reflexin, dispersin)
    causan atenuacin del haz que atraviesa la
    solucin que se deben considerar en la
    medicin. Para compensar estos efectos, se
    coloca una solucin blanco que da cuenta de
    las perdidas anteriores. Esta se conoce como
    solucin o cubeta de referencia.

    Anlisis Cuantitativo:

    Para efectuar el anlisis la radiacin de la fuente luminosa debe ser monocrmatica . Se debe elegir mximo
    para obtener la mxima sensibilidad y minimizar los errores. El espectrofotmetro contiene un monocromador,
    que transforma la luz policromtica en monocromtica. Depende de la calidad de este, que tan buena es esta
    transformacin.

    Se debe establecer el rango de concentracin donde la relacin con la absorbancia es lineal. Depende de la
    absorbilidad de la sustancia. Solo debera usarse el rango lineal.

    Existe un rango de absorbancia ptima para la medicin (alrededor de 0.15-0.7). Esto debido a que en la zona
    de alta absorbancia se producen desviaciones como consecuencia de que la luz que logra pasar es casi nula
    y se confunde con el ruido de fondo. Este rango depende de la calidad del aparato, incluso hay algunos que
    llegan a valores de 3 en absorbancia, pero llevan implcito cierto error. Esto se conoce como desviaciones
    instrumentales.

    Tambin pueden ocurrir desviaciones qumicas de la ley de Beer producto de que las especies que forman la
    muestra interactan y se desva de la linealidad. Esto ocurre a altas concentraciones.
    Para construir la curva de calibracin se toman valores limite de concentracin en los valores 0.15-0.7 de A y
    luego se toma un par de puntos ms. Lo ideal es que la curva de calibracin se construya en las mismas
    condiciones que la muestra (misma matriz). Cuando no procede esto, se puede eliminar el efecto de la matriz
    si se aplica el Mtodo de Adicin Estndar.
    Componentes de un Espectrofotmetro

    1.
    2.
    3.
    4.

    Monocromador: Dispersa la luz y selecciona una longitud de onda


    Colimador: Selecciona de la franja de luz una determinada longitud de onda
    Detector: Transforma los fotones recibidos en una seal elctrica.
    Fuentes radiante: Origen de luz (lamparas)

    General mente se toman dos extremos:


    Blanco 100% de transmitancia
    Objeto opaco 0% de transmitancia
    Luego se toma el valor para la muestra.

    Fuentes radiantes:

    Lampara de Tungsteno no tiene una longitud de onda constante en su radiacin, lo que obliga a calibrar
    el instrumento cada vez que se cambia la longitud de onda.
    Permite medir solo en el rango del espectro visible.

    Lmpara de Deuterio Tambin tiene


    intensidad variable en la longitud de onda
    lo que obliga a recalibrar el instrumento
    cada vez que se varia la longitud de onda.
    Sirve para medir en el rango UV.

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