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Biology

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Published: August 6th, 2020

DOI:

10.3791/61677

1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Clinical and Metabolic Genetics, Hospital for Sick Children, University of Toronto, 3Manton Center for Orphan Disease, Harvard Medical School, Boston Children's Hospital

Este protocolo presenta el ensayo de brotación coroides, un modelo ex vivo de proliferación microvascular. Este ensayo se puede utilizar para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos corooidales y evaluar los tratamientos farmacológicos utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

La angiogénesis coroidal patológica, una característica destacada de la degeneración macular relacionada con la edad, conduce a un deterioro de la visión y ceguera. Los ensayos de proliferación de células endoteliales (EC) que utilizan células endoteliales microvasculares de retina humana (HRMEC) o EC de retina primaria aisladas se utilizan ampliamente en modelos in vitro para estudiar la angiogénesis retiniana. Sin embargo, aislar las células endoteliales de la retina murina pura es técnicamente difícil y las CE de la retina pueden tener diferentes respuestas de proliferación que las células endoteliales coroidales y diferentes interacciones celulares/células. Se desarrolló un ensayo de brotación coroidacional ex vivo altamente reproducible como modelo de proliferación microvascular coroidal. Este modelo incluye la interacción entre la vasculatura coroides (EC, macrófagos, pericitos) y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Los explantes de RPE/coroide/escleral de ratón se aíslan e incuban en el extracto de membrana basal (BME) con factor de crecimiento reducido (BME) (día 0). El medio se cambia cada dos días y la brotación coroides se cuantifica en el día 6. Las imágenes de la explanta de coroides individuales se toman con un microscopio de fase invertida y el área de brotación se cuantifica utilizando un macro plug-in semiautomático para el software ImageJ desarrollado en este laboratorio. Este ensayo de brotación coroidal ex vivo reproducible se puede utilizar para evaluar compuestos para el tratamiento potencial y para la investigación de enfermedades microvasculares para evaluar las vías implicadas en la proliferación de micro vasos coroidacionales utilizando tejido de ratón de tipo salvaje y modificado genéticamente.

La desregulación de la angiogénesis coroidal se asocia con la degeneración macular neovascular relacionada con la edad (AMD)1. La coroides es un lecho microvascular presente debajo del epitelio pigmentario de la retina (RPE). Se ha demostrado que la reducción del flujo sanguíneo en la coroides se asocia con la progresión de AMD2. La intrincada relación entre el endotelio vascular, RPE, macrófagos, pericitos y otras células es responsable de la homeostasis del tejido3,4,5. Por lo tanto, un ensayo reproducible que modela el microa....

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Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en boston Children's Hospital (protocolo ARCH número 19-04-3913R).

1. Preparación

  1. Añadir 5 ml de penicilina/estreptomicina (10000 U/mL) y 5 ml y 10 ml de suplementos disponibles comercialmente a 500 ml de medio clásico completo con suero. Aliquot 50 mL del medio inicialmente.
    NOTA: No devuelva ningún medio a la población para evitar la contaminación.
    2. .......

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Comparación del crecimiento de brotes de coroides por día

Diseccionamos la coroides con esclerótica, incrustada en BME y la cultivamos durante 6 días(Figura 1). El coroides que brota en ratones C57BL/6J desde el día 3 hasta el día 6 fueron examinados con un microscopio y cuantificados con SWIFT-Choroid un método de cuantificación semiautomático en ImageJ. En un caso representativo, la zona de brotación coroidal (los vasos que se extiende.......

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El ensayo coral de brotes ayuda a la investigación en NEOvascular AMD9,10,18,19,20. Los explantes de coroide se pueden aislar de ratones, así como ratas y humanos17,21. El explanto coroides incluye ECs, macrófagos y pericitos17. En este ensayo la interacción entre las CE cor.......

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El trabajo fue apoyado por Grants de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship y Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).

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NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Basal membrane extract (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Cell culture dishNEST70400110cm
Complete classic medium with serum and CultureBoostCell systems4Z0-500
Ethyl alcohol 200 ProofPharmco111000200use for 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MicroscopeZEISSAxio Observer Z1
Penicillin/StreptomycinGIBCO1514010000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamine)AKORN59399-114-10

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