Alcance de los resultados de ensayos en la membrana corioalantoidea del embrión de pollo

Debido al rápido crecimiento vascular que caracteriza a la CAM, esta estructura ha sido el modelo de elección para evaluar el efecto de una gran cantidad de compuestos sobre los vasos en crecimiento. La eficacia de tales compuestos se ha evaluado utilizando métodos cualitativos y cuantitativos basados en la evaluación de la morfología y densidad vascular. Inicialmente, esto se ha hecho puntuando el grado de vascularización en una escala graduada de 0-4 (^{Form & Auerbach, 1983}). Estos compuestos han incluido factores de crecimiento (^{Ribatti et al, 2000}; ^{Ribatti et al, 2001}), hormonas (^{Reuwer et al, 2012}; ^{Chen, Wen & Bai, 2013}) moléculas naturales, agentes anticancerígenos (^{Adar et al, 2012}). Además este método, ha sido empleado en los estudios de desarrollo, crecimiento y metástasis tumoral (^{Weiss et al, 2014}), gases (^{Pipili et al, 2000}), compuestos organometálicos (^{Clavel et al, 2014}; ^{Nazarov et al, 2013}; ^{Nowak et al, 2012}), antibióticos (^{Hu, 1998}), anticuerpos y pequeñas moléculas sintéticas (^{Nowak et al, 2012}; ^{Ribatti et al, 2001}), el transporte de iones (^{Valdes, Kreutzer & Moussy, 2002}; ^{Valdes, Klueh, Kreutzer & Moussy, 2003}), las terapias selectivas de oclusión vascular, la biocompatibilidad de materiales de ingeniería, la distribución de fármacos y la toxicología. A su vez, se ha demostrado el desarrollo del HET-CAM en las enfermedades respiratorias (^{Nowak et al, 2014}) y la cicatrización de heridas.

Específicamente, la prueba de la HET- CAM ha mostrado un uso exitoso en la biología del cáncer y la angiogénesis tumoral. Diversos estudios han comprobado que muchas células tumorales colocadas en la CAM se injertan y siguen todos los pasos de la progresión tumoral: crecimiento, angiogénesis, invasión, extravasación y metástasis. A través de la red altamente vascularizada que ofrece la CAM se logra la viabilidad del tumor en pocos días después del injerto celular, lo que facilita posteriormente la obtención de los medios para el estudio in vivo acerca de la invasión de células tumorales a la luz de los vasos sanguíneos (^{Deryugina & Quigley, 2008}).

Descripción de los ensayos de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo para la evaluación toxicológica y farmacológica

El ensayo CAM se ha utilizado como una plataforma para la experimentación durante más de 50 años y en esta etapa se han desarrollado varios protocolos: ex vivo e in vitro. Debemos destacar que la elección del tipo de protocolo a utilizar, se realiza según el objetivo del estudio.

a) Ensayo ex vivo: En muchos casos, los investigadores rompen el huevo al tercer día de su fertilización y lo transfieren a una placa de Petri de 10 cm de diámetro, a este proceder se le llama cultivo ex vivo del embrión o cultivo de embriones sin caparazón. Este protocolo ofrece un amplio espacio de observación y manipulación, permitiendo analizar varias muestras en una sola CAM. Para este enfoque, los huevos se mantienen primero a 38 °C en una incubadora humidificada (días 0-3). Posteriormente, se hace un pequeño orificio en la cámara de aire para equilibrar la presión y el huevo se transfiere hacia una placa de Petri, manteniendo condiciones de esterilidad, puesto que la propia manipulación se asocia a baja tasa de sobrevivencia del embrión (^{Ribatti et al, 2000}). Para mejorar las tasas de sobrevida embrionaria se deben cumplir una serie de requisitos: reducir el impacto durante el agrietamiento de la cáscara del huevo mediante el uso de una sierra circular, colocar el embrión en un espacio curvo confinado como la placa de Petri para el cultivo de este embrión, mantener la humedad en la incubadora al 98% o más, con la esterilidad recomendada. Usando estos enfoques, la viabilidad es de alrededor del 50% en el día 14 (^{Dohle et al, 2009}).

b) Ensayo in vitro: El cultivo in vitro constituye una alternativa que mejora significativamente la supervivencia de los embriones. Los huevos fertilizados se transfieren a la incubadora equipada con un rotador automático durante tres días. El giro evita que el embrión se adhiera a las membranas de la concha, como lo haría si se deja en una posición durante demasiado tiempo. Se pueden obtener buenos resultados girando los huevos a primera hora de la mañana, durante el mediodía y a última hora de la noche. Alternativamente, el uso de un equipo automático permite un movimiento lento, pero constante de los huevos.

El proceso de cultivo in vivo se inicia también al tercer día de la fertilización. En este momento, debe crearse un orificio de aproximadamente 3 mm de diámetro en la cáscara del huevo con unas pinzas estériles y cubrirse con una película de laboratorio para evitar la deshidratación y posibles infecciones. Luego, los huevos se devuelven a la incubadora con una humedad relativa del aire del 65% y una temperatura de 37 °C en una posición estática hasta su uso. Esta pequeña incisión inicial cambia la presión dentro del huevo y evita la unión de la CAM con la membrana de la cáscara. En el día 7 o más tarde, el orificio se extiende a un diámetro de aproximadamente 3 cm para proporcionar acceso a la CAM. Este enfoque todavía permite la experimentación a través de una ventana y ofrece un entorno fisiológico casi sin cambios para el embrión en desarrollo (^{Nowak et al, 2014}).

Dependiendo del país y las regulaciones se permite que los embriones de aves se desarrollen hasta la etapa de eclosión, generalmente en el día 21 después de la fertilización (^{Nowak et al, 2014}).

c) Evaluación toxicológica:

c.1) Ensayo de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo (HET-CAM).

En el sistema del HET-CAM, se evalúan tres cambios en el sistema vascular: hemorragia, lisis y coagulación en la CAM al noveno día del período embrionario cuando el tejido nervioso y la percepción del dolor aún no se han desarrollado (^{Itagaki, Hagino & Kato, 1995}).

Los huevos de gallina se incuban durante 10 días, después de ese tiempo los huevos defectuosos se descartan. Los huevos seleccionados, se colocan de forma vertical con la parte más ancha hacia arriba (zona donde se encuentra la cámara del aire). La cáscara alrededor de la celda de aire, se recorta de forma circular, utilizando unas tijeras. Esta porción de la cáscara y las membranas internas se extraen cuidadosamente para revelar la CAM. De esta manera se observa una primera membrana blanquecina, que se humedece con 2 ml de solución salina (0,9%) durante 5 min, y luego se retira la capa con una pinza metálica. Se realiza por triplicado (o sea, se emplean tres huevos por cada sustancia). Después, las sustancias de ensayo se añaden a la membrana y se dejan en contacto durante 5 min. La membrana se examina y se registra el tiempo de aparición de los cambios vasculares (coagulación, lisis y hemorragia), indicativos de lesión. El grado de irritación se obtiene de acuerdo con la gravedad y la velocidad a la que se produce el daño (^{Taype, 2015}).

En el diseño experimental, para los grupos controles, solo se emplean dos huevos y se utiliza la solución de NaOH 0,1N o laurilsulfato de sodio (SDS) 2% como control positivo y como control negativo la solución de NaCl 0,9%; (p/v) en solución salina fisiológica, de ambas sustancias controles, también se aplican sobre la CAM 0,3 ml. Transcurrido ese tiempo (5 min) se retira el exceso de producto lavando con agua destilada y se observa la membrana para valorar la posible aparición de los fenómenos descritos anteriormente. Se anota el tiempo de aparición en segundos durante un tiempo máximo de observación de 5min (^{Itagaki et al, 1995}).

El tiempo (segundos) de la aparición de hemorragia, lisis y coagulación se anota dentro de los 5 minutos y se ingresar los datos a la siguiente ecuación:

Esta fórmula brinda el promedio de los índices de irritabilidad del producto utilizado, y según la clasificación de la tabla 1, se le asigna un rango de irritabilidad.

En este ensayo, generalmente se utiliza la determinación del tiempo de reacción hasta la aparición de cada uno de los tres puntos finales. Otro método es la determinación del umbral de irritación, que evalúa la concentración del material de ensayo en el que se observan los efectos sobre estos parámetros. Considerando que estos enfoques se utilizan principalmente para sustancias transparentes, un tercer enfoque para materiales insolubles y sólidos no transparentes puede ser utilizado mediante la exposición de la CAM para analizar muestras durante un tiempo fijo (30 segundos o 5 minutos) y el análisis de los puntos finales después de enjuagar para eliminar la muestra. Se ha encontrado que el período de exposición de 5 minutos a la sustancia de ensayo es suficiente para revelar efectos tóxicos/irritantes (la exposición más amplia no parece producir cualquier información adicional) (^{Itagaki et al, 1995}).

Tabla 1  Clasificación para determinar la irritabilidad del producto, mediante método HET-CAM. 

Fuente:^{García, Gleiby, Montes de Oca & Hidalgo, 2004};^{Luepke, 1985}.

c.2) Ensayo de irritabilidad en membrana corioalantoidea vascular del embrión de pollo (CAMVA).

El ensayo de irritabilidad en membrana corioalantoidea vascular del embrión de pollo (CAMVA, siglas en inglés) evalúa los posibles efectos perjudiciales que las sustancias irritantes oculares potenciales producen en los vasos sanguíneos de la CAM del embrión. En la preparación de este ensayo se corta una pequeña abertura en la cáscara del huevo cuatro días después de la fertilización y una pequeña cantidad de albúmina se elimina para permitir el crecimiento óptimo de la CAM. La abertura se vuelve a cerrar herméticamente y los huevos se incuban durante 6 días. El tiempo máximo de utilización de la CAM, en este ensayo se ha limitado a 10 días con el fin de cumplir con la legislación en los países de la Unión Europea que prohíbe los experimentos en embriones de pollo, mayores de 10 días (^{Taype, 2015}).

En el décimo día, la sustancia de ensayo se aplica directamente sobre una pequeña área de la CAM. Después de la exposición durante 30 minutos se examinan los cambios vasculares en la CAM, por ejemplo, hemorragia, lisis, la aparición de vasos desprovistos de flujo de sangre (vasos fantasmas). La concentración de las sustancias en el ensayo que suscitan tales efectos perjudiciales en el 50% de los huevos, se calcula como parámetro toxicológico. Las sustancias activas actuarán sobre las células musculares lisas para dilatar o contraer los vasos capilares. El método CAMVA se utiliza en la industria cosmética principalmente en los EE.UU. para la evaluación de la seguridad de los cosméticos. El diseño de tejidos humanos in vitro ha suplantado a los ensayos basados en la CAM, para las empresas (^{Taype, 2015}).

c.3) Ensayo de la irritación de la membrana corioalantoideadel embrión de pollo mediante tinción con azul de tripán (CAM-TBS).

La valoración de la posible capacidad de un producto de causar irritación ocular utilizando el método HET-CAM presenta el inconveniente de la subjetividad del experimentador a la hora de detectar la aparición de los efectos adversos. Para evitar eso, se desarrolló una nueva estrategia, el CAM-TBS que valora la capacidad del colorante azul de tripán de penetrar a través de las membranas lesionadas. En este ensayo se determina la cantidad de colorante absorbido por la CAM después de haber entrado en contacto con el producto, siendo así un método cuantitativo (^{Martínez, 2007}).

El procedimiento experimental se basa en el protocolo INVITTOX N°108. Una vez expuesta la membrana al producto se depositan 0,5 mL de solución de azul de tripán0,1 % en solución buffer fosfato (PBS) y se deja actuar durante 1 min. Después de este tiempo, se lava la membrana, se corta y se coloca en una placa Petri con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. A partir de aquí, el protocolo incorporó una modificación respecto al protocolo INVITTOX dado que, para determinar la cantidad de colorante adsorbido en la membrana lavada, esta se pesa y se introduce en un tubo con 5mL de formamida para extraer el colorante fijado al tejido. Cuando la formamida extrae todo el colorante, se descarta la membrana y se realiza la lectura de absorbancia de las muestras (^{Martínez, 2007}) (^{Itagaki et al, 1995}).

La absorbancia de la formamida se mide con el colorante azul de tripán y se compara frente a una recta patrón con concentraciones conocidas de este, a una longitud de onda de 595 nm. La detección del colorante absorbido por el espectrofotómetro indica la pérdida de la integridad de la CAM que es determinada mediante la ecuación siguiente:

*La cantidad de colorante absorbido es el resultado del método HET-CAM TBS (cuantitativo), ya que indica el daño ocasionado en la membrana corioalantoidea que es cuantificado por el espectrofotómetro.

Para aplicar la fórmula anteriormente mencionada, primero se tiene que hallar la concentración de colorante por ploteo con la curva de azul de tripán:

b = ((Abs - 0,0507) /41197) /mg de tejido

Luego se procede a aplicar la fórmula CA = b x 5/1000 x 10⁹nmoles para determinar la cantidad de colorante absorbido.

Esta fórmula brinda el promedio de los índices de irritabilidad del producto utilizado, y según la clasificación de la tabla 2, se le asigna un rango de irritabilidad.

d) Evaluación farmacológica:

d.1) Ensayo de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo en un modelo de cicatrización.

El estudio comienza con la fertilización del embrión de pollo y de acuerdo con ^{Hamburger & Hamilton, 1951}; se incuban para el comienzo de su embriogénesis en una incubadora con una humedad relativa por debajo del 60% y 37⁰C.

En una etapa posterior se realiza un agujero pequeño en la cáscara de huevo de manera suave, para la apertura de esa capa y posteriormente se extrae 2-3 ml de clara de huevo para despegar la CAM de esa porción del huevo (^{Ribatti, Vacca, Ranieri & Roncali, 1996}).

El agrietamiento realizado en la cáscara del huevo se cubre y se coloca en un recipiente de vidrio o cristal para luego ser trasladado hacia la incubadora. Posteriormente, se realiza una pequeña y profunda escisión de grosor de (1mm²) en el área de la CAM a través de la cámara de vacío directamente sobre los vasos sanguíneos más extensos con ayuda de un micrótomo bajo un microscopio Zeiss SR (Zeiss, Oberkochen, Germany). Luego, las muestras obtenidas se almacenan en una incubadora bajo condiciones estériles (^{Ribatti et al, 1996}).

En este ensayo se emplea un microscopio para evaluar la respuesta proliferativa en la cámara. Pasadas las 96-120 horas después de la ejecución los embriones y sus membranas se fijan en solución Bouin. Después de fijadas las CAMs se extraen para seleccionar una porción de cada muestra seriada, y luego cada tira de 7µm se incrusta en parafina. Posteriormente se tiñen las muestras en azul de tolueno para las diferentes determinaciones (^{Ribatti et al, 1996}). En este modelo se evalúa la respuesta angiogénica, teniendo en cuenta el área de escisión y las distintas áreas de la CAM, las cuales se identifican como controles sin daños. Además, se realiza el conteo de fibroblastos y se evaluó el número de vesículas pequeñas mediante el método de recuento de puntos (^{Ribatti et al, 1995}).

Bases que propician la introducción del método de la membrana corioalantoidea del embrión de pollo.

En primer lugar, se debe destacar, que los ensayos de toxicología, siguen protocolos bien definidos (^{European Union, 2013}). Los protocolos que se realizan in vivo, de acuerdo con los criterios de la Organización para el Desarrollo y la Cooperación Económica (OECD, siglas en inglés) tienen implícito el cumplimiento de las tres “erres” (Reemplazo, Refinamiento y Reducción) (^{OECD, 1987}). Sin embargo, no se puede dejar de mencionar que estos métodos ocasionan graves lesiones y estrés en los animales, incluyendo las limitaciones que estos poseen, con respecto al resultado final, tal es el caso de los ensayos de irritación ocular en conejo (test de ^{Draize) (Draize, Woodard & Calvery, 1944}). Vale resaltar que estos modelos experimentales han sido desarrollados durante décadas como ensayos toxicológicos, aunque el desarrollo de estos ensayos ha sido muy criticado por la comunidad científica. La ciencia hoy en día está abocada en la implementación de otros métodos, seguros, eficaces y sencillos, que pueda reemplazar este tipo de ensayo. Dentro de las limitaciones en cuanto a los resultados, podemos mencionar que, el ojo del conejo, aunque similar en tamaño al ojo humano, difiere de éste en numerosos aspectos, como en su estructura, el pH del humor acuoso y el grosor de la córnea. Estas diferencias en la fisiología, unida a la subjetividad que tiene el ensayo para valorar las lesiones y a la variabilidad de los resultados encontrados al ensayar un mismo producto entre distintos laboratorios, hacen lógicas las objeciones a este ensayo (^{Cornier, Hunter, Billimer & Farage, 1995}).

Por otra parte, el Reglamento 1223/2009 elaborado por la Comisión Europea estableció la prohibición de comercializar productos cosméticos cuya formulación final, ingredientes o combinaciones de ingredientes hayan sido experimentados en animales. Consciente del trabajo y las prioridades en este campo, la Comisión Europea y las autoridades competentes, están haciendo un esfuerzo para validar científicamente métodos alternativos “in vitro” con el fin de llevar a cabo evaluaciones de la seguridad de los productos (^{Adler et al, 2011}).

Por tanto, el modelo de la CAM posee como ventajas, que no requiere la aprobación de los protocolos para el uso de animales de laboratorio, que pueden estar mediados por las exigencias de cada país. El método garantiza el mínimo de dolor y estrés que pudiera ser provocado al embrión por la aplicación de algún producto tóxico, ya que esta técnica se debe realizar en huevos con no más de 10 días de fecundación para evitar sufrimiento (^{Nowak et al, 2014}). Además, este modelo experimental minimiza el uso de animales de laboratorio, y a su vez garantiza el cumplimiento de las "3R" (Reemplazo, Refinamiento y Reducción), la CAM proporciona un excelente paso intermedio antes de la evaluación preclínica (^{Taype, 2015}).

Además, resalta como ventaja prominente la accesibilidad y facilidad del método dado por la visualización en tiempo real del ensayo, lo cual ofrece información beneficiosa y eficiente. A su vez, permite evaluar una amplia variedad de formulaciones, ya que se pueden utilizar tanto productos líquidos, como polvos e incluso formas terminadas de los productos (^{Nowak et al, 2014}).